Name: rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Detta projekt finansierades av National Institutes of Health (AI114851) till SR.

1. Generera rekombinationsvektorn
<ol><li>Designa primers för att generera valkassetten. Design varje enskild amplicon med överlappande sekvenser med angränsande amplicons och vektorn för att underlätta isotermisk enzymatisk montering av DNA-molekyler, även kallad Gibson församling, med hjälp av någon av flera online primer designverktyg. Obs: Detta protokoll kan också fyllas i med traditionella begränsning endonuclease-baserade kloningsmetoder. I så fall utforma primers med lämpliga begränsning platse...

<ol>
	<li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine.">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li><li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies;+a+link+between+Jenner+and+Pasteur.">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li><li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Poxviruses.">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li><li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice.">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li><li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy.">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li><li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vaccine+vectors.">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li><li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine.">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li><li>Weir, J. P., Bajsz&#225;r, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA.">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus:+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li><li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+vaccinia+virus:+demonstration+of+marker+rescue.">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara.">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li><li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA.">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li><li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection.">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li><li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1:+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response.">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li><li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects:+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes.">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li><li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+(eIF2)+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation.">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li><li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eIF2&#945;+kinases:+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses.">Evolution of eIF2&#945; kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li><li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes.">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li><li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced,+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase.">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li><li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3:+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain.">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li><li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon.">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li><li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus.">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li><li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-Specific+Host-Virus+Interactions:+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence.">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li><li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact,+synthetic,+vaccinia+virus+early/late+promoter+for+protein+expression.">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+(recombinant+DNA).">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li><li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA/DHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication.">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).</li><li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells.">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li><li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells.">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus.">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li></ol>

Här presenterar vi en variant av en övergående markör urvalsstrategi 32 för att generera rekombinanta vaccinia virus utan att behålla utländska DNA i den slutliga rekombinanta virus. Vår strategi använder selektivt tryck medierat av värdantivirala proteinet PKR snarare än andra former av selektivt tryck som antibiotika. Användningen av hostantivirala gener eliminerar risken för kemiskt inducerade fenotypiska förändringar i cellerna, eller ökad risk för mutation på grund av urvals...

Vaccinia virus (VACV) var avgörande för den första framgångsrika utrotningen av en mänsklig patogen, variola virus (VARV), från naturen. Ända sedan utrotningen av variolavirus har poxvirus inklusive VACV fortsatt att vara användbara terapeutiska virus för både human- och djurmedicin. Ett VACV-baserat rabiesvirusvaccin har till exempel varit mycket effektivt för att förhindra överföring av sylvatiska rabies i Europa1 ochUSA 2. På senare tid har rekombinanta poxvirus som uttrycker en mängd olika antitumörmolekyler (t.ex. enarmade antikroppar eller humana erytropoietin) sett uppmuntrande framgång som onkolytiska medel3,4,5. VACV är särskilt attraktiv som en vektor eftersom det är lätt mottagliga för genetisk manipulation, har ett brett värdområde, och det är stabilt under en mängd olika förhållanden, vilket möjliggör enkel transport och vaccin lönsamhet i fält6,7. Medan flera tekniker har utvecklats för att generera rekombinanta VACV för laboratorieexperiment och vaccin generation, nuvarande strategier för att generera dessa virus har anmärkningsvärda begränsningar.
På grund av nyttan av VACV, flera strategier för att generera rekombinanta virus har utvecklats. Den första strategin använder homolog rekombination för att införa en kassett inklusive transgen och en valbar markör gen som en antibiotikaresistens gen. Kassetten flankeras av två ~500 nukleotider (nt) eller större armar som leder genen till en specifik plats i det virala genomet, som sedan är stabilt integrerad av dubbla crossover händelser8,9,10. Denna strategi är snabb och effektiv. Det resulterar dock i extra genetiskt material i form av markörgenen som kan ge oväntade effekter. Dessutom finns det en praktisk övre gräns för antalet transgener som kan införas begränsas av antalet unika valbara markörer tillgängliga. Övergående dominerande urval (TDS) strategier har tagit upp denna fråga genom att underlätta uppkomsten av "ärrlösa" rekombinanta virus11. Med hjälp av denna strategi integreras en plasmid som innehåller en mutant VACV-gen och en valbar markörgen i virusgenomet, men utan ytterligare flankerande VACV DNA. Detta tillvägagångssätt resulterar i övergående integration av hela plasmid och dubblering av VACV genen som ett resultat av integration av en enda crossover händelse. Denna mellanprodukt är stabil så länge den bibehålls under urvalstryck, vilket möjliggör anrikning av denna konstruktion. När markeringen tas bort möjliggör VACV-dubbelarbete en andra crossover-händelse som resulterar i att plasmid och efterföljande bildning av antingen vildtyp (wt) eller rekombinant virus tas bort i ett ungefärligt 50:50-förhållande. Medan TDS genererar rekombinanta virus utan att kräva en stabil introduktion av främmande DNA, multipel virus kloner måste screenas för den förväntade mutationen genom sekvensering analys, en potentiellt tidskrävande och kostsamma steg.
Här presenterar vi en metod för att generera rekombinanta poxvirus som kombinerar de bästa aspekterna av var och en av dessa metoder, liknande en metod som har beskrivits för replikering inkompetenta modifierade vaccinia Ankara12,13,14. Denna strategi kombinerar visuella och värd intervall urval för att snabbt generera rekombinanta virus genom dubbel crossover händelser, och därefter eliminera valbara markör genen genom homolog rekombination. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb generation av mutanter medierad av homolog rekombination, med "scarless" karaktär TDS metoder, utan att kräva en efterföljande screening steg för att skilja vild typ och mutantvirus. Vår metod använder också värdområde urval i stället för antibiotika urval, vilket eliminerar risken för kemiskt inducerad fenotypiska förändringar i cellinjen. För detta tillvägagångssätt har vi valt att använda värdantivirala proteinkinas R (PKR) som selektivt medel för att generera rekombinant VACV. PKR uttrycks som inaktiv monomer i de flesta celltyper15. Vid bindning av dubbelsträngat RNA (dsRNA) vid N-terminal dsRNA-bindningsdomänerna, dimerizes PKR och är autofosforylerad16. Denna aktiva form av PKR fosforylerar alfa underenheten i eukaryota initieringsfaktor 2 (eIF2), slutligen hämma leverans av initiator metionyl-tRNA till ribosomen, vilket förhindrar intracellulär översättning och i stort sett hämmar replikationen av många virusfamiljer17,18.
Som svar på den breda och potenta antivirala aktiviteten hos PKR har många virus utvecklats med minst en strategi för att förhindra PKR-aktivering. De flesta poxviruses uttrycker två PKR-antagonister, kodade av E3L- och K3L-generna i VACV, som retar upp PKR genom två olika mekanismer19. E3 förhindrar PKR-homodimerisering genom att binda dubbelsträngad RNA20,21, medan K3 fungerar som en pseudosubstratehämmare genom att binda direkt till aktiverad PKR och därigenom hämma interaktionen med dess substrat eIF2α22. Viktigt är att dessa två PKR-antagonister inte nödvändigtvis hämmar PKR från alla arter. Till exempel hämmade K3-homologen från fårkoppsviruset PKR starkt från får, medan fårkopps-E3-homologen inte visade någon större PKR-hämning23,24. I denna studie presenterar vi en metod för att använda PKR-medierat selektivt tryck kombinerat med fluorescensval för att generera en VACV-rekombinant som tagits bort för E3L och K3L (VC-R4), som inte kan replikeras i PKR kompetenta celler som härrör från olika arter. Detta rekombinanta virus ger en utmärkt bakgrund för snabb generation av rekombinanta virus som uttrycker gener under kontroll av den infödda E3L promotorn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492L</td>
			<td>High-fidelity polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11593027</td>
			<td>Bacterial selective agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Scrapers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>Cell scraper to harvest infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto 2 Cell imaging system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD2000</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, GFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4651</td>
			<td>GFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube, RFP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>RFP Cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenJet</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100489</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10855021</td>
			<td>Bacterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA gel extraction kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td>Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>Miniprep kit ussed to purify plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td>Sonicator for virus lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK13 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-37</td>
			<td>Rabbit kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Multiwell Cell Culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Cell culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, seamless generation of recombinant poxviruses using host range and visual selection

Vacciniavirus (VACV) bidrog till att utrota variolavirus (VARV), orsaksmedlet för smittkoppor, från naturen. Sedan den första användningen som vaccin har VACV utvecklats som en vektor för terapeutiska vacciner och som ett onkolytiskt virus. Dessa applikationer dra nytta av VACV: s lätt manipulerade arvsmassa och breda värdsortiment som en enastående plattform för att generera rekombinanta virus med en mängd olika terapeutiska tillämpningar. Flera metoder har utvecklats för att generera rekombinant VACV, inklusive markörvalsmetoder och övergående dominerande urval. Här presenterar vi en förfining av en värd intervall urvalsmetod tillsammans med visuell identifiering av rekombinanta virus. Vår metod drar nytta av selektivt tryck som genereras av värdantivirala proteinkinas R (PKR) tillsammans med en fluorescerande fusion gen som uttrycker mCherry-märktA E3L, en av två VACV PKR antagonister. Kassetten, inklusive genen av intresse och mCherry-E3L fusion flankeras av sekvenser som härrör från VACV-genomet. Mellan genen av intresse och mCherry-E3L är en mindre region som är identisk med de första ~150 nukleotider av 3' arm, för att främja homolog rekombination och förlust av mCherry-E3L genen efter urval. Vi visar att denna metod tillåter effektiv, sömlös generering av rVACV i en mängd olika celltyper utan att kräva läkemedelsval eller omfattande screening för muterade virus.

Vi använde förfarandet diagram i figur 1 för att generera en VACV saknar både PKR antagonister E3L och K3L, genom att ersätta E3L med EGFP i ett virus som redan tagits ut för K3L (vP872). Figur 2 visar röda fluorescerande plack i PKR-behöriga RK13-celler som tyder på viralt uttryck för mCherry-E3L, samt EGFP uttryckt i RK13+E3L+K3L-celler som bekräftar förlusten av E3L och kollaps av urvalsmarkören mCherry-E3L. Figur 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection at JoVE.com

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Detta är en metod för att generera "scarless" rekombinanta vaccinia virus med värd-range urval och visuell identifiering av rekombinanta virus.

Snabb, sömlös generering av rekombinanta Poxviruses med hjälp av värdområde och visuellt urval

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Vår metod använder värdintervallsval och fluorescerande markörer för effektiv och sömlös generering av rekombinant vaccinavirus i en mängd olika celltyper. Denna teknik kombinerar hastigheten på homolog rekombination med scarless karaktär övergående dominerande urval. Dessutom är vi värd intervall urval för att eliminera möjligheten att kemiskt inducerad förändringar.Denna metod kan också användas för att modifiera vacciniavirus eller andra poxvirus för att uttrycka främmande gener, till exempel för att generera vaccin. Om du utför detta protokoll med fluorescens val bara, måste du se till att du screening tillräckligt med virus för att upptäcka en relativt sällsynt rekombinanter utan PKR selektivt tryck. Denna metod bygger på vinst och förlust av fluorescerande markörer för att framgångsrikt välja virus som har förvärvat rekombination kassetter och att upptäcka virus som har ärrlösa rekombinerade.För att generera en rekombinationsvektor, först lägga till 17 mikroliter av DNase fritt vatten, 1,2 mikroliter av varje primer, fem mikroliter 5x PCR reaktionsbuffert, mall DNA, och 0,5 mikroliter dna-polymeras till ett PCR-rör per amplikon. Tillsätt ytterligare DNase fritt vatten för att få den slutliga volymen i varje rör till 50 mikroliter. Och placera rören i en termocyklare.Smält DNA på 98 grader Celsius i 30 sekunder innan du använder 25 rundor av ett trestegs PCR-protokoll som anges. För att visualisera förstärkningsprodukterna på en 1%agarosgel, tillsätt 10 mikroliter av varje DNA-produkt och 2 mikroliter av lastningsbuffert till varje brunn. Kör gelen i en timme vid åtta volt per centimeter.I slutet av körningen, använd en DNA-gel extraktionssats enligt tillverkarens protokoll för att gel rena varje amplicon. Elutera amplikonerna från kolonnen med 50 mikroliter av DNase fritt vatten och omedelbar centrifugering. För att linjärisera en kloningsvektor, tillsätt först ett mikrogram av vektorn, 17 mikroliter DNase fritt vatten, 2 mikroliter reaktionsbuffert och 1 mikroliter EcoRI till ett rör för en en timmes inkubation vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen, tillsätt 0,2 picomoles av den linjäriserade vektorn 10 mikroliter av DNase fritt vatten, och 10 mikroliter av DNA-montering master mix till varje isolerad amplicon. Inkubera prover vid 50 grader Celsius i en timme. Vid slutet av inkubationen omvandlar du kemiskt kompetent E.coli med två mikroliter av den monterade produkten enligt standardprotokoll.Plate 100 mikroliter av transformerade celler på LB agaros plattor kompletteras med 100 mikrogram per milliliter ampicillin. Efter övernattning inkubation vid 37 grader Celsius, välj väl isolerade kolonier för inokulering i Luria buljong kompletteras med 100 mikrogram per milliliter ampicillin över natten på 37 grader Celsius och 225 varv per minut. Nästa morgon, använd en plasmid miniprep kit för att isolera plasmiderna.Och kontrollera DNA:ns koncentration och renhet på en spektrofotometer. För rekombinant virusgenerering infekterar en konfluent monolayer av lämpliga celler med viruset som ska rekombineras vid en multiplikitet av infektion av en i en sex-brunnsplatta. Och inkubera de infekterade cellerna på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i en timme.Vid inkubationens ersätter du supernatanten i varje brunn med färskt DMEM och använder en transfektionsreagens i kommersiellt sett tillgänglig enligt tillverkarens protokoll. Lägg till en tre mikrogram av rekombination vektor av intresse till varje brunn. Placera plattan i inkubatorn i ytterligare 48 timmar.Innan du slår samman cellerna från varje transfektionsvillkor till individuella 1,5 milliliterrör. Sedan frys-tina de poolade cellerna tre gånger innan sonicating den resulterande lysates i 15 sekunder vid en 50%amplitud. Därefter seriellt 10-faldig späd sonicated lysate, skördas från en 10 till den första till 10 till den sjätte koncentrationen i färska DMEM och lägga till en milliliter av varje spädning till enskilda konfluenta brunnar av ett protein kinas R kompetent cellinje.Placera cellerna i cellodlingsinkubatorn i en timme innan du ersätter supernatanterna med färskt medium och återför cellerna till cellodlingsinkubatorn. Efter 24 till 48 timmar, identifiera de rekombinanta virus genom fluorescensmikroskopi. Plack från rekombinanta virus uttrycker röda fluorescens på grund av att integration av mCherry-E3L fusion genen.Plack rena de rekombinanta virusen tre gånger på vilda typ RK13 celler. Efter tre omgångar av plakett rening, infektera RK13 +E3L + K3L celler med seriella utspädningar av plack lysate. För att identifiera de kollapsade virus, genom fluorescens mikroskopi med hjälp av en lämplig bildhantering system utrustad med GFP och RFP filter kuber.Sedan plakett rena grön-bara VC-R4, eller färglösa E3L plack tre gånger på RK13 +E3L + K3L celler. Se till att inga plack fluorescerande rött. Infektera cellerna med minst 100 plack bildar enheter för att öka dina chanser att identifiera en färglös plakett.I sällsynta fall kan flera omgångar av infektion krävas. Röda fluorescerande plack i protein kinase R behöriga RK13 celler är vägledande för viral uttryck av mCherry-E3L. Och färglösa plack eller plack uttrycker endast eGFP i RK13 + E3L + K3L celler bekräftar kollapsen av mCherry-E3L markeringsmarkör.Det rekombinanta viruset VC-R4, som saknar båda proteinkinas R-antagonister kan inte replikera i proteinkinas R behöriga RK13-celler medan det skenbara viruset VP872, som uttrycker E3L är replikerings kompetent. För att bekräfta att denna oförmåga att replikera i RK13 celler var bara på grund av förlusten av E3L, ersattes förbättrad GFP med E3L i VC-R4-viruset. Det genererade ett relevant virus med samma urvalsprotokoll.Intressant, samtidigt som detta virus, färglös plack överensstämmer med kollaps av mCherry-E3L urvalsmarkören identifierades före valet i RK13 +E3L + K3L celler som i allmänhet krävs för att välja ärrlösa rekombinanter. Sannolikt på grund av den utökade sekvensen identitet mellan mCherry-E3L rekombination kassett och E3L genen som sätts in i VC-R4. I genomsnitt 12,6%av avkomma virions genomgick rekombination med den transfected plasmid, liknande tidigare rapporterade frekvenser.Här visas frekvensen av färglösa plack i förhållande till de totala plack RK13 +E3L + K3L celler, visar att graden av kollaps och förlusten av mCherry-E3L markeringsmarkören inträffade vid en cirka 1,8%frekvens. I det första steget med hjälp av PKR kompetenta celler säkerställer att alla av plack med innehöll rekombinant virus. I det andra steget med hjälp av PKR bristfälliga celler möjliggör detektering av rekombinant virus med en kollaps mCherry-E3L locus.Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att snabbt generera virus som innehåller exogena gener, till exempel för vaccinproduktion erbjuder uttryck av olika virala PKR-antagonister. för att underlätta analysen av artspecifika interaktioner med PKR från olika värdar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi screening för Host faktorer som Vaccinia Virus Infektion med Drosophila Celler

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalbar hög genomströmning Urval Från faguppvisade Syntetiska Antibody bibliotek

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuella och mikroskopiska utvärdering av Streptomyces utvecklingsmässiga mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, amplifiering och titrering av rekombinant respiratoriska Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...