Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين منحة (31570921 إلى ZJ، 81571533 إلى LS)، لجنة شنغهاي البلدية للصحة، وتنظيم الأسرة (201540206 إلى ZJ)، Ruijin مستشفى الشمال منحة البحوث (2017ZX01 إلى ZJ).

وقد وافقت لجنة الحيوان التابعة لكلية العلوم الطبية الاساسية بجامعة شانغهاى جياو تونغ على جميع الاساليب الموصوفة هنا .
1- إعداد المواد
<ol><li>استخدم تسلسل MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK MOG35-55 للحصول على الببتيد المنضب من المصادر التجارية. تأكد من أن نقاء الببتيد هو > 95٪. إعداد 10 ملغ / مل MOG حل المخز?...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا للحث على EAE ومراقبته باستخدام MOG35-55 في فئران C57BL/6 ، والتي تعتبر نموذجًا تجريبيًا نموذجيًا لحيوانات الـ MS. EAE يمكن أن يسببه اختلاف سلالات الفئران أو نوع البروتين المستخدم للحث وفقًا لغرض الدراسة. على سبيل المثال، يمكن استخدام PLP139-151 الببتيد في الفئران SJL الحث على د?...

كما مرض مزمن إزالة الغموض من الجهاز العصبي المركزي, التصلب المتعدد يؤثر على حوالي 2.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، ويفتقر إلى العلاجات العلاجية1. كما يعتبر مرض المناعة الذاتية, التي مستضد الميالين محددة T اللمفاويات بدء رد فعل التهابي ويؤدي إلى إزالة الغموض وإصابة محورية في الجهاز العصبي المركزي2. وقد استخدمت على نطاق واسع اختبارية المناعة الذاتية التهاب الدماغ (EAE) للتحقيق في الآليات المسببة للأمراض من مرض التصلب العصبي المتعدد كنموذج كلاسيكي لمرض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي3. هناك طريقتان للحث EAE: واحدة هو حث EAE بنشاط عن طريق تحصين الحيوانات مع مكونات الميالين، وآخر هو نقل بالتبني عن طريق نقل الخلايا التائية الدماغية إلى مستقبلات2،4،5. وssceptibilities إلى EAE مختلفة في سلالات الحيوانات المختلفة6. في C57BL/6 الفئران، myelin oligodendrocyte الجليكوبروتين (MOG) 35-55 التحدي يدفع مرض أحادي الطور مع إزالة الغموض واسعة والتهاب في الجهاز العصبي المركزي، والذي يستخدم في كثير من الأحيان في التجارب مع الفئران الجينات المستهدفة7.
مطلوب توليد خلايا T التفاعلية الخاصة بالميلين لحدوث المرض وتطوره في EAE وهو علامة مناعية لكل من EAE وMS. الخلايا الليمفاوية التائية النشطة تلقائيًا عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الجهاز العصبي المركزي الصحي وبدء مرض EAE. عندما واجهت MOG 35-55 Ag, هذه الخلايا الليمفاوية T الحث التهاب وتجنيد الخلايا في الجهاز العصبي المركزي, مما أدى إلى إزالة الغموض وتدمير محور عصبي8,9. في نموذج EAE ، هناك أدلة وافرة على أن الخلايا CD4+ T الخاصة بـ neuroantigen يمكن أن تبدأ وتحافظ على التهاب الأعصاب وعلم الأمراض3،10. اعتمادا على السيتوكينات الرئيسية المنتجة، تم تصنيف CD4+ T الخلايا الليمفاوية في مجموعات فرعية مختلفة: Th1 (تتميز بإنتاج الإنترفيرون-γ)، Th2 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 4)، و Th17 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 17). ويعتقد أن تفعيل Th1 وTh17 الخلايا تسهم في الاستقراء والصيانة والتنظيم من إزالة الغموض الالتهابي في EAE وMS عن طريق إفراز المنشطات cytokines IFN-γ و IL-17، والتي هي قادرة على تفعيل الضامة وتجنيد العدلات للمواقع الالتهابية لتسريع الآفات11.
لأن الخلايا التائية T عبور BBB في الجهاز العصبي المركزي والحث على تطور المرض في مرض التصلب العصبي المتعدد وEAE، من المهم جدا لتحليل الخلايا التائية في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، هناك عدد قليل جدا من البروتوكولات المنشأة لعزل الخلايا الليمفاوية من الجهاز العصبي المركزي12. لذلك، تم تطوير طريقة محسنة لعزل الخلايا أحادية النوى من الدماغ وتحليل الخلايا الليمفاوية T مع علامات CD45، CD11b، CD3، CD4، INF-g، و IL-17 للمعالجة الخلية تدفق. تستخدم هذه الطريقة MOG35-55 adjuvant Mycobacterium Tuberculoss H37 Ra و Pertussis التكسين حل العمل (PTX) للحث على نموذج التمنيع النشط من EAE في الفئران. ثم يتم استخدام طرق الطرد المركزي للانفصال الميكانيكي والكثافة لعزل خلايا النوى الأحادية في الجهاز العصبي المركزي. وأخيراً، يتم استخدام استراتيجية جسور جسور للخلايا تدفق الأمثل لتحديد الخلايا الليمفاوية T و المجموعات الفرعية من الدماغ عن طريق تلطيخ علامات متعددة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

التصلب المتعدد (MS) هو مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي (CNS) الناجم عن مزيج من العوامل البيئية والخلفية الوراثية المعرضة للخطر. التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض نموذجي من التصلب المتعدد يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في التسبب في الأمراض التي تائية الخلايا الليمفاوية محددة لمستضدات المايلين بدء تفاعل التهابي في الجهاز العصبي المركزي. من المهم جدا لتقييم كيفية الخلايا الليمفاوية في الجهاز العصبي المركزي تنظيم تطور المرض. ومع ذلك ، فإن نهج قياس كمية ونوعية الخلايا الليمفاوية المخترقة في الجهاز العصبي المركزي محدودة للغاية بسبب الصعوبات في عزل واكتشاف الخلايا الليمفاوية المتسللة من الدماغ. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً يفيد في عزل الخلايا اللمفاوية المخترقة من الجهاز العصبي المركزي وتحديدها وتوصيفها، وستكون مفيدة لفهمنا لكيفية مشاركة الخلايا اللمفاوية في تطوير مرض المناعة الذاتية التابع لل CNS.

بعد تطعيم فئران C57BL/6، تم وزن جميع الفئران وفحصها وتدّينها يوميًا بحثًا عن العلامات العصبية. وينبغي أن يؤدي الدورة السريرية ممثل EAE في منحنى المرض كما هو معروض في الشكل 2A وتغيير وزن الجسم في الماوس كما هو معروض في الشكل 2B. C57BL/6 الفئران المحصنة مع MOG35-55 بدأت عاد?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً للحث على التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي النشط (EAE) في الفئران. كما يتم تقديم طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية المتسللة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لإظهار كيفية مشاركة الخلايا الليمفاوية في تطور مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي.

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

البروتوكول الذي نقدمه هنا سيكون مفيداً لنا لفهم كيفية مشاركة الخلايا اللمفاوية في تطوير مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي. مع هذه الطريقة، يمكن دراسة الخلايا الليمفاوية في الدماغ دراسة على أساس خلية من قبل الخلية. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على نماذج أخرى وأمراض الجهاز العصبي المركزي التي تحتاج إلى تحليل خصائص ووظائف الخلايا المناعية.في هذا الفيديو، يمكن للبروتوكول أن يوضح بسهولة كيفية حث النموذج وعزل الخلايا الفردية في الدماغ. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، واستخدام حقنة ملليلتر واحد لحقن تحت الجلد C57BL/6 الفئران مع 100 ميكروغرام من MOG مستحلب 35-55 في 100 ميكرولترات من مساعد فروند كاملة في موقعين مختلفين من الظهر بالقرب من الرقبة. في نفس اليوم وفي اليوم الثاني بعد التحصين ، حقن داخل الصفاق الفئران مع 200 ميكرولتر من نانوغرام واحد لكل ميكرولتر السعال الديكي السموم حل.بعد الحقنة الثانية، نقل الفئران مرة أخرى إلى قفص وطنهم مع وسادة الاحترار والرصد حتى إعادة شغل كامل. في اليوم التالي وطوال فترة المرض ، فحص ورتب جميع الفئران بطريقة عمياء للعلامات العصبية المبينة في الجدول ولأي تغييرات في الوزن. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بقطع الجمجمة بعناية من الأنف إلى الرقبة ونقل دماغ كل من صندوق الجمجمة إلى أنابيب فردية 50 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلترات من متوسط RPMI.خلط الأنابيب جيدا لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتزم بها وإزالة المتوسطة عن طريق الطموح. إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل أنبوب ونقل العقول إلى أطباق فردية 100 ملليمتر. وأخيرا فرم كل دماغ مع شفرة حلاقة واستخدام ماصة بلاستيكية لنقل قدر الأنسجة من طبق واحد في وقت واحد وستة ملليلتر من المتوسط إلى الجليد سبعة ملليلتر محورها التجانس الزجاج.طحن الدماغ باستخدام المكبس فضفاضة من الحشرات قبل استخدام المكبس ضيق لجلب الأنسجة حتى تعليق متجانسة. ثم، صب الطين الأنسجة الناتجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مبردة مسبقا على الجليد. عندما تم تجانس جميع العينات، وضبط حجم في كل أنبوب إلى سبعة ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، قبل إضافة كل تعليق الأنسجة إلى أنبوب جديد المبرد 15 ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 100٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل أنبوب.مزيج عن طريق عكس عدة مرات واستخدام ماصة ملليلتر ثلاثة بعناية وببطء إضافة ملليلتر واحد من 70 في المئة حل التدرج كثافة تحت كل عينة حل الأنسجة. فصل الخلايا بواسطة كثافة التدرج الطرد المركزي وإزالة تقريبا كل من الطبقة العليا، مع الحرص على إزالة تماما من myelin. نقل واجهة في أنبوب جديد 15 ملليلتر وضبط مستوى الصوت إلى 10 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة.ثم الطرد المركزي العينات مرة أخرى وإزالة supernatant قبل resuspending الكريات في حوالي 100 ميكرولترات من المتوسط لكل أنبوب. لتحليل تدفق الخلايا للخلايا للخلايا المخ المحصودة، تخصيص ما يقرب من مرتين 10 الخلايا الست في 100 ميكرولترات من المتوسط في آبار فردية من لوحة 96 جيدا. عندما تم مطلي جميع الخلايا، إضافة 100 ميكرولترات من 500X كوكتيل تحفيز الخلايا بالإضافة إلى مثبطات نقل البروتين إلى الآبار ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات.في نهاية تجمع الحضانة الخلايا في الجزء السفلي من الآبار عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من تدفق العازلة قياس الخلايا في البئر. قبل احتضان الخلايا مع ثلاثة microliters من المضادة للماوس CD16/CD32 FC بلوك لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية قبل تلطيخ. لمنع أي تفاعلات غير محددة بوساطة Fc.في نهاية الحضانة، إضافة كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة لكل بئر ووضع لوحة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. بعد 30 دقيقة، وغسل الآبار مع 100 ميكرولترات من تدفق عازلة قياس الخلايا في بئر ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المُنَازل، أضف 200 ميكرولترات من عازل التثبيت داخل الخلايا إلى كل بئر.بعد حضانة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من 1X نفاذية العازلة في بئر. الطرد المركزي العينات مرة أخرى، وبعد التخلص من supernatant، resuspend الكريات في 100 ميكرولترات مع عازلة permeabilization جديدة. بعد ذلك، إضافة الأجسام المضادة المناسبة للكشف عن أي مستضدات داخل الخلايا من الفائدة لاحتضان 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من 1X عازلة permeabilization لكل بئر وتدور أسفل العينات عن طريق الطرد المركزي. ثم، resuspend الخلايا وصمة عار في 200 ميكرولترات من تدفق الخلايا التلطخ العازلة وتحليل الخلايا عن طريق تدفق القياسات وفقا للبروتوكولات القياسية. وينبغي أن يؤدي مسار السريرية النموذجية من EAE في منحنى المرض وتغيير في وزن الجسم كما هو موضح.C57BL/6 الفئران المحصنة مع MOG 35-55 عادة ما تبدأ في تطوير أعراض المرض حول اليوم 10 إلى 12 وتحقيق ذروة المرض حول اليوم 15 إلى 21. قبل ظهور المرض ، يزداد وزن الجسم للفئران المحصنة تدريجيًا قبل أن يتناقص ارتباطًا مع أعراض المرض المتزايدة تظهر الفئران أدنى وزن في الجسم في ذروة EAE ، مع تعافي أوزان الجسم قليلاً مع انخفاض الأعراض السريرية. الفئران عادة لا يتعافى تماما ولكن وعادة ما تستمر لتطوير أمراض الأمراض المزمنة أحادية الطور.كما يوضح هذا التحليل التدفق التمثيلي، يتم زيادة خلايا Th1 وTH17 المنتجة للانفيردون غاما بشكل كبير في فئران EAE. الخطوة الأكثر أهمية هي 3.10. يجب على المشغل نقل الطبقة الوسطى والضوء ، ويجري بعناية ، واتخاذ أقل عدد ممكن من الطبقات الأخرى.بعد هذه البروتوكولات، يمكننا المزيد من الخلايا الليمفاوية T لمزيد من التحليل النسخي للدراسة

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

التغلب على عدم التجاوب في التجارب الذاتية التهاب الدماغ (EAE) سلالات الفئران المقاومة للنقل بواسطة بالتبني والتحدي الأنتيجين

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

المايلين دبقية قليلة التغصن جلايكوبروتين (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) المستحثة التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ (EAE) في C57BL / 6 الفئران

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

جهاز تحديد المواقع لوضع الفئران أثناء تسليم siRNA داخل الأنف إلى الجهاز العصبي المركزي

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...