Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China tilskud (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningstilskud (2017ZX01 til ZJ).

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af dyrene udvalg af School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Fremstilling af materialerne
<ol><li>Brug MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK sekvensen af MOG35-55 til at opnå det frysede peptid fra kommercielle kilder. Sørg for, at peptidets renhed er >95%. Der klargøres 10 mg/ml MOG-lageropløsning i fosfatbufferet saltvand (PBS), og der opbevares ved -20 °C.</li>
	<li>Der klargør en 4 mg/ml stockopløsning af M. tub...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Denne undersøgelse præsenterer en protokol til at fremkalde og overvåge EAE ved hjælp af MOG35-55 i C57BL/6 mus, som betragtes som en typisk neuroimmunologisk eksperimentel dyremodel af MS. EAE kan induceres varierende mus stammer eller den type protein, der anvendes til induktion i henhold til formålet med undersøgelsen. For eksempel, ved hjælp af PLP139-151 peptid i SJL mus kan fremkalde en recidiveløsning-remitterende EAE sygdom kursus, der er særligt velegnet til vurdering af terapeutiske virkninger på tilb...

Som en kronisk demyeliniserende sygdom i CNS, MS påvirker omkring 2,5 millioner mennesker på verdensplan og mangler helbredende behandlinger1. Det betragtes også som en autoimmun sygdom, hvor myelin antigen specifikke T lymfocytter indlede en inflammatorisk reaktion og føre til demyelinisering og axonal skade i CNS2. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er blevet udbredt til at undersøge patogene mekanismer af MS som en klassisk autoimmun demyelinær sygdom model i CNS3. Der er to måder at fremkalde EAE: den ene er at fremkalde EAE aktivt ved at immunisere dyr med myelin komponenter, en anden er adoptivoverførsel ved at overføre encephalitogenic T-celler i receptor2,,4,5. Modtageligheden for EAE er forskellige i forskellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus, myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) 35-55 udfordring inducerer en monofasisk sygdom med omfattende demyelinisering og betændelse i CNS, som ofte anvendes i forsøg med gen-målrettede mus7.
Generering af myelinspecifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og udvikling af sygdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverede autoreaktive T-lymfocytter krydser blod-hjernebarrieren (BBB) i den sunde CNS og initierer EAE-sygdommen. Når MOG 35-55 Ag er stødt på, disse T lymfocytter fremkalde betændelse og rekruttering af effektor celler i CNS, resulterer i demyelinisering og axon destruktion8,9. I EAE-modellen er der rigelige beviser for, at neuroantigenspecifikke CD4+ T-celler kan initiere og opretholde neuroinflammation og patologi3,10. Afhængigt af de vigtigste cytokiner, der produceres, er CD4+ T-lymfocytter blevet klassificeret i forskellige delmængder: Th1 (karakteriseret ved produktion af interferon-γ), Th2 (karakteriseret ved produktion af interleukin 4) og Th17 (karakteriseret ved produktion af interleukin 17). Det menes, at aktivering af Th1 og Th17 celler bidrage til induktion, vedligeholdelse og regulering af inflammatorisk demyelinisering i EAE og MS ved at udskille effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til at aktivere makrofager og rekruttere neutrofiler til de steder inflammatoriske at fremskynde læsioner11.
Da autoreaktive T-celler krydser BBB i CNS og fremkalder sygdomsudvikling i MS og EAE, er det meget vigtigt at analysere T-celler i CNS. Der er dog meget få etablerede protokoller for isolering af lymfocytter fra CNS12. Derfor blev der udviklet en metode, der er optimeret til isolering af mononukleare celler fra hjernen og analyse af T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for flowcytometri. Metoden bruger MOG35-55 adjuvans Mycobacterium tuberkulose H37 Ra og Pertussis Toksin Working Solution (PTX) til at fremkalde en aktiv immuniseringsmodel af EAE i mus. Derefter anvendes mekaniske adskillelses- og tæthedsgradientueringsmetoder til isolering af CNS mononukleare celler. Endelig bruges en optimeret flow cytometri gating strategi til at identificere T lymfocytter og delmængder fra hjernen ved farvning flere markører.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multipel sklerose (MS) er en autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) forårsaget af kombinationen af miljømæssige faktorer og modtagelig genetisk baggrund. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en typisk sygdomsmodel af MS, der i vid udstrækning anvendes til undersøgelse af patogenese, hvor T-lymfocytter, der er specifikke for myelinantigener, indleder en inflammatorisk reaktion i CNS. Det er meget vigtigt at vurdere, hvordan lymfocytter i CNS regulere udviklingen af sygdom. Men, tilgang til måling af mængden og kvaliteten af infiltrerede lymfocytter i CNS er meget begrænset på grund af vanskelighederne med at isolere og detektere infiltrerede lymfocytter fra hjernen. Dette manuskript præsenterer en protokol for, der er nyttig for isolering, identifikation og karakterisering af infiltrerede lymfocytter fra CNS og vil være nyttigt for vores forståelse af, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmune sygdom.

Efter immunisering af C57BL/6 mus blev alle mus vejet, undersøgt og klassificeret dagligt for neurologiske tegn. EAE's repræsentative kliniske forløb bør resultere i en sygdomskurve som præsenteret i figur 2A og en ændring af kropsvægten i musen som præsenteret i figur 2B. C57BL/6 mus immuniseret med MOG35-55 normalt begyndte at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10-12 og opnåede toppen af sygdommen omkring dag 15-21 efter aktiv immunisering (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Dette manuskript præsenterer en protokol til at fremkalde aktiv eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i mus. En metode til isolering og karakterisering af de infiltrerede lymfocytter i centralnervesystemet (CNS) præsenteres også for at vise, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmun sygdom.

Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Den protokol, vi præsenterer her, vil være nyttigt for os at forstå, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af centralnervesystemet autoimmun sygdom. Med denne metode, lymfocytter i hjernen kan studeres på celle for celle basis. Denne protokol kan også anvendes på andre modeller og centralnervesystemet sygdom, der er nødvendige for at analysere de karakteristika og funktioner af immunceller.I denne video kan protokollen nemt demonstrere, hvordan man inducerer model og isolere enkelte celler i hjernen. Efter at have bekræftet manglende reaktion på pedalrefleks, skal du bruge en en milliliter sprøjte til subkutant injicere bedøvet C57BL/6 mus med 100 mikrogram emulgeret MOG 35-55 i 100 mikroliter af komplet Freund's adjuvans i to forskellige steder i ryggen nær halsen. Samme dag og på dag to postimmunisering injicerer intraperitoneally musene med 200 mikroliter af et nanogram pr. mikroliter pertussis-toksinarbejdsløsning.Efter den anden injektion, overføre musene tilbage til deres hjem bur med en opvarmning pad og overvågning, indtil fuld recumbency. Den næste dag og i hele sygdomsforløbet undersøge og grade alle mus i en blindet måde for de neurologiske tegn, der er skitseret i tabellen og for eventuelle ændringer i vægt. Ved det relevante eksperimentelle endepunkt skæres kraniumet omhyggeligt fra næsen til halsen, og hjernen for hvert dyr overføres fra kraniekassen til individuelle 50 milliliterrør indeholdende 10 milliliter RPMI-medium.Bland rørene godt at fjerne de klæbende røde blodlegemer og fjerne mediet ved aspiration. Tilsæt 10 milliliter frisk medium til hvert rør og overføre hjerner i individuelle 100 millimeter retter. Endelig hugge hver hjerne med en barbermaskine og bruge en plastik pipette til at overføre så meget væv fra en skål ad gangen og seks milliliter medium i en icecold syv milliliter centreret glas homogenisator.Grind hjernen ved hjælp af løs stemplet af støderen, før du bruger den stramme stemplet til at bringe vævet, indtil suspensionen er homogen. Derefter hældes den resulterende vævsgylle i et forkølet 15 milliliter konisk rør på is. Når alle prøverne er homogeniseret, justeres volumenet i hvert rør til syv milliliter med frisk medium, før hver vævssuspension til et nyt kølet 15 milliliterrør indeholdende tre milliliter 100% kældermembranmatrix pr. rør.Bland ved inversion et par gange og bruge en tre milliliter pipette til omhyggeligt og langsomt tilføje en milliliter 70 procent tæthed gradient løsning under hver vævsopløsning prøve. Adskaf cellerne ved tæthedsgradientuering og fjern næsten hele det øverste lag, idet du skal passe på helt at fjerne alle myelinen. Overfør grænsefladen til et nyt 15 milliliterrør, og juster lydstyrken til 10 milliliter med frisk medium.Derefter centrifuge prøverne igen og fjerne supernatant før resuspending pellets i omkring 100 mikroliter af medium pr rør. For flow cytometrisk analyse af de høstede hjerneceller, afsætte ca to gange 10 til de seks celler i 100 mikroliter af medium i individuelle brønde af en 96-brønd plade. Når alle cellerne er blevet belagt, tilsættes 100 mikroliter 500X cellestimulering cocktail plus protein transport hæmmere til brøndene og placere pladen i cellen kultur inkubator i fire timer.I slutningen af inkubationspuljen cellerne i bunden af brøndene ved centrifugering og resuspenderet pellets i 100 mikroliter af flow cytometri buffer per brønd. Præinkubere cellerne med tre mikroliter anti-mus CD16/CD32 Fc Block i 10 minutter ved fire grader Celsius før farvning. For at blokere alle uspecifikke Fc-medierede interaktioner.I slutningen af inkubationen tilsættes antistofcocktailen af interesse til hver brønd og anbring pladen ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Efter 30 minutter vaskes brøndene med 100 mikroliter flowcytometribuffer pr. brønd og sediment cellerne ved centrifugering. Efter kassering af supernatanterne tilsættes 200 mikroliter intracellulær fikseringsbuffer til hver brønd.Efter 30 til 60 minutters inkubation ved stuetemperatur udtages prøverne ved centrifugering og pellets i 200 mikroliter af 1X permeabilitetsbuffer pr. brønd. Centrifuge prøverne igen, og efter udsmid af supernatant, resuspend pellets i 100 mikroliter med frisk permeabilization buffer. Dernæst tilsættes de relevante antistoffer til påvisning af eventuelle intracellulære antigener af interesse for en 30 minutters inkubation ved fire grader Celsius, beskyttet mod lys.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 100 mikroliter 1X permeabiliseringsbuffer til hver brønd og drejer prøverne ned ved centrifugering. Derefter resuspenderede pletcellerne i 200 mikroliter af flow cytometri farvning buffer og analysere cellerne ved flow cytometri i henhold til standard protokoller. Et typisk klinisk forløb af EAE bør resultere i en sygdomskurve og ændring i kropsvægt som illustreret.C57BL/6 mus immuniseret med MOG 35-55 begynder normalt at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10 til 12 og opnå toppen af sygdommen omkring dag 15 til 21. Før sygdommens indtræden stiger kropsvægten af immuniserede mus gradvist, før den falder i sammenhæng med de stigende sygdomssymptomer Musene viser den laveste kropsvægt på toppen af EAE, hvor kropsvægten stiger en smule, efterhånden som de kliniske symptomer falder. Musene normalt ikke fuldt ud komme sig dog og typisk gå på at udvikle en monofasisk kronisk sygdom patologi.Som denne repræsentative flowanalyse illustrerer, øges interferongammaproducerende Th1- og IL17-producerende Th17-celler betydeligt i EAE-mus. Det vigtigste skridt er 3.10. Operatøren skal overføre mellemlag og lys, være omhyggeligt, tage så få andre lag som muligt.Efter denne protokol kan vi yderligere T lymfocytter til yderligere transskriptionsanalyse for at

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinde unresponsiveness i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) Resistente musestammer ved adoptiv overførsel og antigenudfordring

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin oligodendrocyt Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i C57BL / 6 mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometri af partikelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel og effektiv produktion og oprensning af Mouse Myelin oligodendrocyt Glycoprotein for Eksperimentel Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Cytometric flowmåling af ROS produktion i makrofager i svar til FcγR tværbinding

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

En positionerings anordning til placering af mus under intranasal siRNA-levering til central nervesystemet

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...