Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door De Nationale Toekenning van de Wetenschap van China (31570921 aan ZJ, 81571533 aan LS), De Gemeentelijke Commissie van Shanghai van Gezondheid, en De Planning van de familie (201540206 aan ZJ), Het onderzoekstoelage van het Ziekenhuis Ruijin Noord (2017ZX01 aan ZJ).

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het comité voor dieren van de School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Bereiding van de materialen
<ol><li>Gebruik de MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK sequentie van MOG35–55 om het gelyofilifiiseerde peptide uit commerciële bronnen te verkrijgen. Zorg ervoor dat de zuiverheid van het peptide is >95%. Bereid 10 mg/mL MOG voorraadoplossing voor in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Berei...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Deze studie presenteert een protocol voor het induceren en monitoren van EAE met behulp van MOG35-55 in C57BL/6 muizen, die worden beschouwd als een typisch neuroimmunologisch experimenteel diermodel van MS. EAE kan worden geïnduceerd variërend van de muizenstammen of het type eiwit dat wordt gebruikt voor inductie volgens het doel van de studie. Bijvoorbeeld, met behulp van PLP139-151 peptide bij SJL muizen kan leiden tot een relapsing-remitting EAE ziekte cursus die vooral goed geschikt is voor het beoordelen van the...

Als een chronische demyeliniserende ziekte van het CNS, MS treft ongeveer 2,5 miljoen mensen wereldwijd en mist curatieve behandelingen1. Het wordt ook beschouwd als een auto-immuunziekte, waarbij myeline-antigeenspecifieke T-lymfocyten een ontstekingsreactie initiëren en leiden tot demyelinatie en axonale schade in het CNS2. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is op grote schaal gebruikt om pathogene mechanismen van MS te onderzoeken als een klassiek auto-immuundemyeminatieziektemodel in CNS3. Er zijn twee manieren om EAE te induceren: een is om EAE actief te induceren door dieren te immuniseren met myeline componenten, een andere is adoptie-overdracht door het overbrengen van encefalogene T-cellen in receptor2,4,5. De gevoeligheden voor EAE zijn verschillend in verschillende dierlijke stammen6. In C57BL/6 muizen veroorzaakt myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35–55 uitdaging een monofasische ziekte met uitgebreide demyelinatie en ontsteking in het CNS, die vaak wordt gebruikt in experimenten met gengerichte muizen7.
De generatie van myeline-specifieke reactieve T-cellen is vereist voor het optreden en de ontwikkeling van de ziekte in EAE en is een immunologisch teken van zowel EAE als MS. Geactiveerde autoreactieve T-lymfocyten kruisen de bloedhersenbarrière (BBB) in het gezonde CZS en initiëren de ZIEKTE van EAE. Wanneer MOG 35–55 Ag wordt aangetroffen, veroorzaken deze T-lymfocyten ontstekingen en de rekrutering van effectorcellen in het CZS, wat resulteert in demyelinatie en axonvernietiging8,9. In het EAE-model is er voldoende bewijs dat neuroantigen-specifieke CD4+ T-cellen neuro-ontsteking en pathologie3,10kunnen initiëren en ondersteunen. Afhankelijk van de belangrijkste geproduceerde cytokinen zijn CD4+ T-lymfocyten ingedeeld in verschillende subsets: Th1 (gekenmerkt door de productie van interferon-γ), Th2 (gekenmerkt door de productie van interleukine 4) en Th17 (gekenmerkt door de productie van interleukine 17). Er wordt aangenomen dat activering van Th1- en Th17-cellen bijdraagt aan de inductie, het onderhoud en de regulering van ontstekingsdemyelinatie in EAE en MS door effectorcytokines IFN-γ en IL-17 te scheiden, die in staat zijn om macrofagen te activeren en neutrofielen te rekruteren voor de ontstekingssites om de laesies te versnellen11.
Omdat autoreactive T-cellen de BBB oversteken in het CZS en de ontwikkeling van ziekte bij MS en EAE veroorzaken, is het erg belangrijk om T-cellen in het CZS te analyseren. Er zijn echter zeer weinig protocollen voor de isolatie van lymfocyten uit het CNS12. Daarom is een methode ontwikkeld die is geoptimaliseerd voor het isoleren van mononucleaire cellen uit de hersenen en het analyseren van T-lymfocyten met markers CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g en IL-17 voor flow cytometrie. De methode maakt gebruik van MOG35–55 adjuvans Mycobacterium tuberculosis H37 Ra en Pertussis Toxine Working Solution (PTX) om een actief immunisatiemodel van EAE bij muizen te induceren. Vervolgens worden mechanische scheidings- en dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethoden gebruikt voor de isolatie van CNS mononucleaire cellen. Ten slotte wordt een geoptimaliseerde flow cytometrie gating strategie gebruikt om T lymfocyten en subsets uit de hersenen te identificeren door meerdere markers te beitsen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multiple sclerose (MS) is een auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CNS) veroorzaakt door de combinatie van omgevingsfactoren en gevoelige genetische achtergrond. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is een typisch ziektemodel van MS dat op grote schaal wordt gebruikt voor het onderzoeken van de pathogenese waarbij T-lymfocyten specifiek voor myelineantigen een ontstekingsreactie in CNS initiëren. Het is zeer belangrijk om te beoordelen hoe lymfocyten in het CNS de ontwikkeling van de ziekte reguleren. Echter, de aanpak voor het meten van de hoeveelheid en de kwaliteit van geïnfiltreerde lymfocyten in het CNS is zeer beperkt als gevolg van de moeilijkheden bij het isoleren en detecteren van geïnfiltreerde lymfocyten uit de hersenen. Dit manuscript presenteert een protocol voor dat nuttig is voor de isolatie, identificatie en karakterisering van geïnfiltreerde lymfocyten uit het CNS en zal nuttig zijn voor ons begrip van hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van de CNS auto-immuunziekte.

Na vaccinatie van C57BL/6 muizen werden alle muizen gewogen, onderzocht en dagelijks beoordeeld op neurologische verschijnselen. Het representatieve klinische verloop van de EAE moet resulteren in een ziektecurve zoals gepresenteerd in figuur 2A en een verandering van lichaamsgewicht in de muis zoals gepresenteerd in figuur 2B. C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOG35-55 meestal begonnen met het ontwikkelen van symptomen van de ziekte rond dag 10-12 en bereikte d...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Het protocol dat we hier presenteren zal nuttig zijn voor ons om te begrijpen hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel auto-immuunziekte. Met deze methode kunnen lymfocyten in de hersenen per cel worden bestudeerd. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere modellen en de ziekte van het centrale zenuwstelsel die nodig zijn om de kenmerken en functies van immuuncellen te analyseren.In deze video kan het protocol gemakkelijk aantonen hoe u model induceert en enkele cellen in de hersenen kan isoleren. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, gebruik een een milliliter spuit onderhuids injecteren verdoofd C57BL/6 muizen met 100 microgram van geëmulgeerde MOG 35-55 in 100 microliter van complete Freund's adjuvans in twee verschillende sites van de rug in de buurt van de nek. Op dezelfde dag en op dag twee na de communicatie, intraperitoneally injecteren van de muizen met 200 microliters van een nanogram per microliter pertus toxine toxine werkende oplossing.Na de tweede injectie, breng de muizen terug naar hun kooi thuis met een opwarming pad en monitoring tot volledige recumbency. De volgende dag en in de loop van de ziekte, onderzoeken en beoordelen van alle muizen op een geblindeerde manier voor de neurologische symptomen beschreven in de tabel en voor eventuele veranderingen in gewicht. Snijd op het juiste experimentele eindpunt de schedel voorzichtig van de neus naar de nek en breng de hersenen van elk dier van de schedeldoos over in individuele 50 milliliter buizen met 10 milliliter RPMI-medium.Meng de buizen goed om de aanhangende rode bloedcellen te verwijderen en verwijder het medium door aspiratie. Voeg 10 milliliter vers medium toe aan elke buis en breng de hersenen over in individuele 100 millimeter schotels. Tot slot hak elke hersenen met een scheermes en gebruik een plastic pipet om zo veel weefsel van een schotel op een moment en zes milliliter medium in een ijskoude zeven milliliter gecentreerd glas homogenisator.Maal de hersenen met behulp van de losse zuiger van de stamper voor het gebruik van de strakke zuiger om het weefsel te brengen totdat de suspensie homogeen is. Giet vervolgens de resulterende weefseldrijfmest in een voorgekoelde conische buis van 15 milliliter op ijs. Wanneer alle monsters zijn gehomogeniseerd, pas het volume in elke buis aan op zeven milliliter met vers medium, voordat elke weefselsuspensie wordt toegevoegd aan een nieuwe gekoelde buis van 15 milliliter met drie milliliter van 100%keldermembraanmatrijs per buis.Meng door inversie een paar keer en gebruik een drie milliliter pipet om zorgvuldig en langzaam een milliliter van 70 procent dichtheid gradiënt oplossing onder elk weefsel oplossing monster toe te voegen. Scheid de cellen door dichtheidgradiënt centrifugatie en verwijder bijna alle van de bovenste laag, waarbij ervoor wordt gezorgd dat alle myeline volledig te verwijderen. Breng de interface over in een nieuwe buis van 15 milliliter en pas het volume aan op 10 milliliter met vers medium.Dan centrifugeren de monsters opnieuw en verwijder de supernatant alvorens de pellets opnieuw in ongeveer 100 microliter van medium per buis. Voor flow cytometrische analyse van de geoogste hersencellen, toewijzen ongeveer twee keer 10 aan de zes cellen in 100 microliter van medium in individuele putten van een 96-put plaat. Wanneer alle cellen zijn verguld, voeg 100 microliters van 500X cel stimulatie cocktail plus eiwit transport remmers aan de putten en plaats de plaat in de cel cultuur incubator voor vier uur.Aan het einde van de incubatie pool de cellen aan de onderkant van de putten door centrifugatie en resuspend de pellets in 100 microliters van flow cytometrie buffer per goed. Pre-incubeer de cellen met drie microliters van Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius voordat u kleurt. Om niet-specifieke door de Fc gemedieerde interacties te blokkeren.Voeg aan het einde van de incubatie de antilichaamcocktail van belang toe aan elke put en plaats de plaat op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Na 30 minuten, was de putten met 100 microliters van stroom cytometrie buffer per goed en sediment de cellen door centrifugatie. Na het verwijderen van de supernatants, voeg 200 microliters van intracellulaire fixatie buffer aan elke put.Na een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur, verzamel de monsters door centrifugatie en resuspend de pellets in 200 microliters van 1X permeabiliteit buffer per goed. Centrifuge de monsters opnieuw, en na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellets in 100 microliters met verse permeabilisatie buffer. Voeg vervolgens de juiste antilichamen toe voor de detectie van intracellulaire antigenen van belang gedurende een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht.Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliter 1x permeabilisatiebuffer toe aan elke put en draai de monsters door centrifugatie. Vervolgens, resuspend de vlekcellen in 200 microliters van flow cytometrie kleuring buffer en analyseren van de cellen door stroom cytometrie volgens standaard protocollen. Een typisch klinisch verloop van EAE moet resulteren in een ziektecurve en verandering in lichaamsgewicht zoals afgebeeld.C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met MOG 35-55 beginnen meestal ziektesymptomen te ontwikkelen rond dag 10 tot 12 en bereiken de piek van de ziekte rond dag 15 tot 21. Vóór het begin van de ziekte neemt het lichaamsgewicht van geïmmuniseerde muizen geleidelijk toe voordat het afneemt in correlatie met de toenemende ziektesymptomen De muizen tonen het laagste lichaamsgewicht aan op het hoogtepunt van EAE, waarbij het lichaamsgewicht enigszins herstelt naarmate de klinische symptomen afnemen. De muizen herstellen meestal echter niet volledig en ontwikkelen meestal een monofasische chronische ziektepathologie.Zoals deze representatieve stroomanalyse illustreert, worden interferon gammaproducerende Th1- en IL17-producerende Th17-cellen aanzienlijk verhoogd in EAE-muizen. De belangrijkste stap is 3.10. De operator moet de middelste laag overbrengen en het licht, zorgvuldig zijnd, neem zo weinig mogelijk andere lagen.Volgens dit protocol kunnen we verder T-lymfocyten voor verdere transcriptie-analyse om te bestuderen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Een positionerings apparaat voor de plaatsing van muizen tijdens intranasale siRNA levering aan het centrale zenuwstelsel

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...