Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par la subvention de la National Natural Science Foundation of China (31570921 à ZJ, 81571533 à LS), la Commission municipale de la santé de Shanghai et la planification familiale (201540206 à ZJ), la subvention de recherche de l’hôpital Ruijin Nord (2017ZX01 à ZJ).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité animal de l’École des sciences médicales de base de l’Université Jiao Tong de Shanghai.
1. Préparation des matériaux
<ol><li>Utilisez la séquence MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35–55 pour obtenir le peptide lyophilisé de sources commerciales. Assurez-vous que la pureté du peptide est >95%. Préparer une solution de bouillon de MOG de 10 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver ...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Cette étude présente un protocole pour induire et surveiller l’EAE à l’aide de MOG35-55 chez les souris C57BL/6, qui sont considérées comme un modèle animal expérimental neuroimmunologique typique de la SP. EAE peut être induit variant les souches de souris ou le type de protéine utilisé pour l’induction selon le but de l’étude. Par exemple, l’utilisation du peptide PLP139–151 chez les souris SJL peut induire un cours de la maladie eae qui est particulièrement bien adapté pour évaluer les effets...

En tant que maladie de démyélinisation chronique du SNC, la SP touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde et manque de traitements curatifs1. Il est également considéré comme une maladie auto-immune, dans laquelle les lymphocytes T spécifiques à l’antigène myélin initient une réaction inflammatoire et conduisent à la démyélinisation et aux lésions axonales dans le SNC2. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) a été largement utilisée pour étudier les mécanismes pathogènes de la SP comme modèle classique de maladie auto-immune de la maladie de démyélinisation dans le SNC3. Il existe deux façons d’induire EAE: l’une est d’induire EAE activement en immunisant les animaux avec des composants de myéline, un autre est le transfert d’adoption en transférant les lymphocytes T encéphalitogènes dans le récepteur2,4,5. Les susceptibilités à l’EAE sont différentes dans différentes souches animales6. Chez les souris C57BL/6, le défi de la glycoprotéine de l’oligodendrocyte de myéline (MOG) 35–55 induit une maladie monophasique avec une démyélinisation et une inflammation étendues dans le SNC, qui est fréquemment utilisé dans des expériences avec des sourisgéniquesciblées 7 .
La génération de lymphocytes T réactifs spécifiques à la myéline est nécessaire pour l’apparition et le développement de la maladie dans l’EAE et est un signe immunologique de l’EAE et de la SP. Les lymphocytes T autoréactifs activés traversent la barrière hémato-encéphalique (BBB) dans le SNC sain et initient la maladie d’EAE. Lorsque MOG 35–55 Ag est rencontré, ces lymphocytes T induisent l’inflammation et le recrutement de cellules effecteurs dans le SNC, ce qui entraîne la démyélinisation et la destruction de l’axone8,9. Dans le modèle EAE, il existe de nombreuses preuves que les cellules CD4+ T spécifiques aux neuroantigènes peuvent initier et soutenir la neuroinflammation et la pathologie3,10. Selon les principales cytokines produites, les lymphocytes CD4+ T ont été classés en différents sous-ensembles : Th1 (caractérisé par la production d’interféron-γ), Th2 (caractérisé par la production d’interleukine 4) et Th17 (caractérisé par la production d’interleukine 17). On croit que l’activation des cellules Th1 et Th17 contribuent à l’induction, l’entretien et la régulation de la démyélinisation inflammatoire dans EAE et sp en sécrétant les cytokines effecteurs IFN-γ et IL-17, qui sont capables d’activer les macrophages et de recruter des neutrophiles aux sites inflammatoires pour accélérer les lésions11.
Étant donné que les lymphocytes T autoréactifs traversent le BBB dans le SNC et induisent le développement de maladies dans la SP et l’EAE, il est très important d’analyser les lymphocytes T dans le SNC. Cependant, il existe très peu de protocoles établis pour l’isolement des lymphocytes du SNC12. Par conséquent, une méthode optimisée pour isoler les cellules mononucléaires du cerveau et analyser les lymphocytes T avec des marqueurs CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g et IL-17 pour la cytométrie de flux a été développée. La méthode utilise MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxine Working Solution (PTX) pour induire un modèle de vaccination active de l’EAE chez les souris. Ensuite, des méthodes mécaniques de centrifugation de gradient de séparation et de densité sont utilisées pour l’isolement des cellules mononucléaires du SNC. Enfin, une stratégie optimisée de gating de cytométrie de flux est employée pour identifier les lymphocytes T et les sous-ensembles du cerveau en tachant plusieurs marqueurs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

La sclérose en plaques (SP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) causée par la combinaison de facteurs environnementaux et de milieux génétiques sensibles. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle typique de la maladie de MS largement utilisé pour étudier la pathogénie dans laquelle les lymphocytes T spécifiques aux antigènes de myéline initient une réaction inflammatoire dans le SNC. Il est très important d’évaluer comment les lymphocytes du SNC régulent le développement de la maladie. Cependant, l’approche pour mesurer la quantité et la qualité des lymphocytes infiltrés dans le SNC est très limitée en raison des difficultés à isoler et à détecter les lymphocytes infiltrés du cerveau. Ce manuscrit présente un protocole qui est utile pour l’isolement, l’identification, et la caractérisation des lymphocytes infiltrés du SNC et sera utile pour notre compréhension de la façon dont les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune du SNC.

Après la vaccination des souris C57BL/6, toutes les souris ont été pesées, examinées et classées quotidiennement pour des signes neurologiques. Le cours clinique représentatif de l’EEE devrait entraîner une courbe de la maladie telle qu’elle est présentée à la figure 2A et un changement de poids corporel chez la souris tel que présenté à la figure 2B. C57BL/6 souris immunisées avec MOG35-55 ont généralement commencé à développer des sympt...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Le protocole que nous présentons ici sera utile pour nous de comprendre comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune du système nerveux central. Avec cette méthode, les lymphocytes dans le cerveau peuvent être étudiés sur une base cellulaire. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres modèles et la maladie du système nerveux central qui avait besoin d’analyser les caractéristiques et les fonctions des cellules immunitaires.Dans cette vidéo, le protocole peut facilement démontrer comment induire le modèle et isoler les cellules individuelles dans le cerveau. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, utilisez une seringue d’un millilitre pour injecter sous-cutanément des souris C57BL/6 anesthésiées avec 100 microgrammes de MOG émulsionné 35-55 dans 100 microlitres de l’adjuvant complet de Freund dans deux emplacements différents du dos près du cou. Le même jour et le deuxième jour après l’immunisation, injecter intraperitoneally les souris avec 200 microlitres d’un nanogramme par solution de travail de toxine de pertussis de microlitre.Après la deuxième injection, transférez les souris dans leur cage d’origine avec un coussin chauffant et surveillez jusqu’à la pleine récumbence. Le lendemain et tout au long de la maladie, examiner et grade toutes les souris d’une manière aveuglée pour les signes neurologiques décrits dans le tableau et pour tout changement de poids. Au point de terminaison expérimental approprié, coupez soigneusement le crâne du nez au cou et transférez le cerveau de chaque animal de la boîte crânienne en tubes individuels de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu RPMI.Bien mélanger les tubes pour enlever les globules rouges adhérents et enlever le milieu par aspiration. Ajouter 10 millilitres de milieu frais à chaque tube et transférer le cerveau dans des plats individuels de 100 millimètres. Enfin hacher chaque cerveau avec un rasoir et utiliser une pipette en plastique pour transférer autant de tissu d’un plat à la fois et six millilitres de milieu dans un homogénéiseur en verre centré de sept millilitres.Moudre le cerveau à l’aide du piston lâche du pilon avant d’utiliser le piston serré pour apporter le tissu jusqu’à ce que la suspension soit homogène. Verser ensuite le lisier tissulaire qui en résulte dans un tube conique pré-refroidi de 15 millilitres sur la glace. Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, ajuster le volume de chaque tube à sept millilitres avec un milieu frais, avant d’ajouter chaque suspension tissulaire à un nouveau tube réfrigéré de 15 millilitres contenant trois millilitres de matrice membranaire 100% sous-sol par tube.Mélanger par inversion à quelques reprises et utiliser une pipette de trois millilitres pour ajouter soigneusement et lentement une millilitre de solution de gradient de densité de 70 pour cent sous chaque échantillon de solution tissulaire. Séparez les cellules par centrifugation de gradient de densité et enlevez presque toute la couche supérieure, en prenant soin d’enlever complètement toute la myéline. Transférer l’interface dans un nouveau tube de 15 millilitres et ajuster le volume à 10 millilitres avec un milieu frais.Puis centrifuger les échantillons à nouveau et enlever le supernatant avant de résuspendre les granulés dans environ 100 microlitres de milieu par tube. Pour l’analyse cytométrique de flux des cellules cérébrales récoltées, allouer environ deux fois 10 aux six cellules dans 100 microlitres de milieu dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits. Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, ajouter 100 microlitres de cocktail de stimulation cellulaire 500X plus inhibiteurs du transport des protéines aux puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.À la fin de la piscine d’incubation, les cellules au fond des puits par centrifugation et réutilisent les granulés dans 100 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement par puits. Pré-incubation des cellules avec trois microlitres d’Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avant de tacher. Pour bloquer toute interaction non spécifique avec le Fc.À la fin de l’incubation, ajouter le cocktail d’anticorps d’intérêt à chaque puits et placer l’assiette à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Après 30 minutes, laver les puits avec 100 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement par puits et sédimenter les cellules par centrifugation. Après avoir jeté les supernatants, ajouter 200 microlitres de tampon de fixation intracellulaire à chaque puits.Après une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante, recueillir les échantillons par centrifugation et resuspendre les granulés dans 200 microlitres de tampon de perméabilité 1X par puits. Centrifugez les échantillons à nouveau, et après avoir jeté le supernatant, réutilisez les granulés dans 100 microlitres avec tampon de perméabilisation fraîche. Ensuite, ajoutez les anticorps appropriés pour la détection de tous les antigènes intracellulaires d’intérêt pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de tampon de perméabilisation 1X à chaque puits et faire tourner les échantillons par centrifugation. Ensuite, resuspendez les cellules de tache dans 200 microlitres de tampon de coloration de cytométrie d’écoulement et analysez les cellules par cytométrie de flux selon les protocoles standard. Un cours clinique typique d’EAE devrait avoir comme conséquence une courbe de maladie et le changement du poids corporel comme illustré.Les souris C57BL/6 vaccinées avec mog 35-55 commencent habituellement à développer des symptômes de la maladie autour du jour 10 à 12 et atteignent le pic de la maladie autour du jour 15 à 21. Avant l’apparition de la maladie, le poids corporel des souris vaccinées augmente graduellement avant de diminuer en corrélation avec les symptômes croissants de la maladie Les souris démontrent le poids corporel le plus bas au sommet de l’EAE, avec des poids corporels se rétablissent légèrement à mesure que les symptômes cliniques diminuent. Les souris ne se rétablissent généralement pas complètement cependant et se développent typiquement une pathologie monophasique de maladie chronique.Comme l’illustre cette analyse représentative du flux, les cellules Th11 et Th17 productrices d’interféron produisant du gamma sont considérablement augmentées chez les souris EAE. L’étape la plus importante est 3.10. L’opérateur doit transférer la couche moyenne et la lumière, en étant soigneusement, prendre aussi peu d’autres couches que possible.En suivant ces protocoles, nous pouvons poursuivre les lymphocytes T pour une analyse plus poussée de la transcription

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

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Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Un dispositif de positionnement pour le placement des souris pendant la livraison de siRNA intranasal au système nerveux central

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...