Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Diese Forschung wurde unterstützt durch national Natural Science Foundation of China Grant (31570921 an ZJ, 81571533 to LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 to ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 to ZJ).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Tierausschuss der School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, genehmigt.
1. Herstellung der Materialien
<ol><li>Verwenden Sie die MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-Sequenz von MOG35–55, um das lyophilisierte Peptid aus kommerziellen Quellen zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Reinheit des Peptids >95% beträgt. 10 mg/ml MOG-Stammlösung in phosphatgepufferter Saline (PBS) vorbereiten und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie e...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Induktion und Überwachung von EAE mit MOG35-55 bei C57BL/6-Mäusen, die als typisches neuroimmunologisches Versuchstiermodell von MS gelten. EAE kann induziert werden, indem die Mäusestämme oder die Art des Proteins, das für die Induktion verwendet wird, entsprechend dem Zweck der Studie variiert werden. Beispielsweise kann die Verwendung von PLP139–151 Peptid bei SJL-Mäusen einen schubförmigen EAE-Krankheitsverlauf induzieren, der besonders gut geeignet ist, um therape...

Als chronische demyelinisierende Erkrankung des ZNS betrifft MS etwa 2,5 Millionen Menschen weltweit und es fehlt an kurativen Behandlungen1. Es gilt auch als eine Autoimmunerkrankung, bei der Myelin-Antigen-spezifische T-Lymphozyten eine Entzündungsreaktion auslösen und zu Demyelination und Axonalverletzungen im ZNS2führen. Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) wurde weit verbreitet verwendet, um pathogene Mechanismen von MS als klassisches Autoimmun-Demyelination-Krankheitsmodell in CNS3zu untersuchen. Es gibt zwei Möglichkeiten, EAE zu induzieren: eine besteht darin, EAE aktiv durch Immunisierung von Tieren mit Myelinkomponenten zu induzieren, eine andere ist der Adoptivtransfer durch Übertragung enzephalitogener T-Zellen in Rezeptor2,4,5. Die Anfälligkeit für EAE unterscheidet sich in verschiedenen Tierstämmen6. Bei C57BL/6-Mäusen induziert Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35–55-Herausforderung eine monophasische Erkrankung mit umfangreicher Demyelination und Entzündung im ZNS, die häufig in Experimenten mit gengezielten Mäusen verwendet wird7.
Die Erzeugung von Myelin-spezifischen reaktiven T-Zellen ist für das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten bei EAE erforderlich und ist ein immunologisches Zeichen von EAE und MS. Aktivierte autoreaktive T-Lymphozyten überqueren die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das gesunde ZNS und initiieren EAE-Krankheit. Wenn MOG 35–55 Ag angetroffen wird, induzieren diese T-Lymphozyten Entzündungen und die Rekrutierung von Effektorzellen in das ZNS, was zu Demyelination und Axonzerstörung8,9führt. Im EAE-Modell gibt es genügend Hinweise darauf, dass neuroantigenspezifische CD4+ T-Zellen Neuroinflammation und Pathologie3,10initiieren und aufrecht erhalten können. Je nach den wichtigsten produzierten Zytokinen wurden CD4+ T-Lymphozyten in verschiedene Teilmengen eingeteilt: Th1 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interferon-γ), Th2 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 4) und Th17 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 17). Es wird angenommen, dass die Aktivierung von Th1- und Th17-Zellen zur Induktion, Wartung und Regulierung der entzündlichen Demyelination bei EAE und MS beiträgt, indem sie die Effektor-Zytokine IFN-γ und IL-17 sezernieren, die in der Lage sind, Makrophagen zu aktivieren und Neutrophile an den entzündlichen Stellen zu rekrutieren, um die Läsionen zu beschleunigen11.
Da autoreaktive T-Zellen die BBB in das ZNS kreuzen und die Entwicklung von Krankheiten bei MS und EAE induzieren, ist es sehr wichtig, T-Zellen im ZNS zu analysieren. Es gibt jedoch nur sehr wenige etablierte Protokolle für die Isolierung von Lymphozyten aus dem ZNS12. Daher wurde eine Methode entwickelt, die für die Isolierung mononukleantin Zellen aus dem Gehirn und die Analyse von T-Lymphozyten mit den Markern CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g und IL-17 für die Durchflusszytometrie optimiert ist. Die Methode verwendet MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra und Pertussis Toxin Working Solution (PTX), um ein aktives Immunisierungsmodell von EAE bei Mäusen zu induzieren. Anschließend werden mechanische Trenn- und Dichtegradientenzentrifugationsmethoden zur Isolierung von Mononuklezellen von ZNS eingesetzt. Schließlich wird eine optimierte Flusszytometrie-Gating-Strategie verwendet, um T-Lymphozyten und Teilmengen aus dem Gehirn zu identifizieren, indem mehrere Marker gefärbt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch die Kombination von Umweltfaktoren und empfänglichem genetischen Hintergrund verursacht wird. Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) ist ein typisches Krankheitsmodell von MS, das weit verbreitet ist, um die Pathogenese zu untersuchen, bei der T-Lymphozyten, die speziell für Myelin-Antigene sind, eine Entzündungsreaktion bei ZNS auslösen. Es ist sehr wichtig zu beurteilen, wie Lymphozyten im ZNS die Entwicklung von Krankheiten regulieren. Der Ansatz zur Messung der Menge und Qualität infiltrierter Lymphozyten im ZNS ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Isolierung und Detektion infiltrierter Lymphozyten aus dem Gehirn sehr begrenzt. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll, das für die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung infiltrierter Lymphozyten aus dem ZNS nützlich ist und hilfreich für unser Verständnis der Rolle der Lymphozyten bei der Entwicklung der CNS-Autoimmunerkrankung sein wird.

Nach der Immunisierung von C57BL/6-Mäusen wurden alle Mäuse täglich auf neurologische Symptome gewogen, untersucht und eingestuft. Der repräsentative klinische Verlauf des EAE sollte zu einer Krankheitskurve führen, wie in Abbildung 2A dargestellt, und zu einer Veränderung des Körpergewichts in der Maus, wie in Abbildung 2Bdargestellt. C57BL/6 Mäuse, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, begannen in der Regel um tag 10–12 Krankheitssymptome zu entwickel...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Das Protokoll, das wir hier vorstellen, wird uns helfen zu verstehen, wie Lymphozyten an der Entwicklung der Autoimmunerkrankung des zentralnervösen Systems beteiligt sind. Mit dieser Methode können Lymphozyten im Gehirn auf Zellbasis untersucht werden. Dieses Protokoll kann auch auf andere Modelle und Erkrankungen des zentralen Nervensystems angewendet werden, die benötigt werden, um die Eigenschaften und Funktionen von Immunzellen zu analysieren.In diesem Video kann das Protokoll leicht zeigen, wie man Modellier- und Isolatiateinzelner Zellen im Gehirn induziert. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf pedalreflex bestätigt haben, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um anästherisierte C57BL/6-Mäuse mit 100 Mikrogramm emulgierter MOG 35-55 in 100 Mikrolitern kompletten Freund-Adjuvans in zwei verschiedene Stellen des Rückens in der Nähe des Halses subkutan zu injizieren. Am selben Tag und am zweiten Tag nach der Immunisierung injizieren die Mäuse intraperitoneal die Mäuse mit 200 Mikrolitern eines Nanogramms pro Mikroliter Pertussistoxin-Arbeitslösung.Nach der zweiten Injektion, übertragen Sie die Mäuse zurück in ihren heimischen Käfig mit einem wärmenden Pad und Überwachung bis zur vollen Rekonsthestorei. Am nächsten Tag und während des Verlaufs der Krankheit, untersuchen und gradieren Alle Mäuse in einer geblendeten Weise für die neurologischen Zeichen in der Tabelle und für alle Änderungen im Gewicht. Schneiden Sie den Schädel am entsprechenden experimentellen Endpunkt vorsichtig von der Nase bis zum Hals und übertragen Sie das Gehirn jedes Tieres aus der Schädelbox in einzelne 50-Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter RPMI-Medium.Mischen Sie die Schläuche gut, um die anhaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen und entfernen Sie das Medium durch Aspiration. Fügen Sie 10 Milliliter frisches Medium zu jeder Röhre hinzu und übertragen Sie das Gehirn in einzelne 100-Millimeter-Gerichte. Schließlich hacken Sie jedes Gehirn mit einem Rasiermesser und verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um so viel Gewebe von einer Schale nach der anderen und sechs Milliliter Medium in einen eiskalten sieben Milliliter zentrierten Glas Homogenisator zu übertragen.Schleifen Sie das Gehirn mit dem lockeren Kolben des Stößes, bevor Sie den engen Kolben verwenden, um das Gewebe zu bringen, bis die Suspension homogen ist. Dann gießen Sie die resultierende Gewebeschlämme in eine vorgekühlte 15 Milliliter konische Röhre auf Eis. Wenn alle Proben homogenisiert sind, stellen Sie das Volumen in jedem Rohr auf sieben Milliliter mit frischem Medium ein, bevor Sie jede Gewebesuspension zu einem neuen gekühlten 15-Milliliter-Rohr hinzufügen, das drei Milliliter 100%Kellermembranmatrix pro Tube enthält.Mischen Sie durch Inversion ein paar Mal und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Pipette, um sorgfältig und langsam einen Milliliter 70 Prozent Dichte Gradient lösung unter jeder Gewebelösung Probe hinzufügen. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientzentrifugation und entfernen Sie fast die gesamte obere Schicht, wobei darauf zu achten ist, dass das gesamte Myelin vollständig entfernt wird. Übertragen Sie die Schnittstelle in ein neues 15-Milliliter-Rohr und stellen Sie das Volumen mit frischem Medium auf 10 Milliliter ein.Dann zentrifugieren Sie die Proben wieder und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Pellets in etwa 100 Mikroliter Medium pro Röhre wieder aufhängen. Für die zytometrische Durchflussanalyse der geernteten Gehirnzellen, ordnen Sie etwa zwei Mal 10 zu den sechs Zellen in 100 Mikrolitern Medium in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte. Wenn alle Zellen plattiert sind, fügen Sie 100 Mikroliter 500X Zellstimulationscocktail plus Proteintransportinhibitoren in die Brunnen und legen Sie die Platte für vier Stunden in den Zellkultur-Inkubator.Am Ende der Inkubationsbecken die Zellen am Boden der Brunnen durch Zentrifugation und resuspendieren die Pellets in 100 Mikroliter Durchflusszytometrie Puffer pro Brunnen. Die Zellen mit drei Mikrolitern Anti-Maus CD16/CD32 Fc Block 10 Minuten bei vier Grad Celsius vorderinbrüten, bevor sie färben. So blockieren Sie alle unspezifischen Fc-vermittelten Interaktionen.Am Ende der Inkubation, fügen Sie den Antikörper-Cocktail von Interesse zu jedem Brunnen und legen Sie die Platte bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt. Nach 30 Minuten die Brunnen mit 100 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer pro Brunnen waschen und die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Nach dem Wegwerfen der Überstand, fügen Sie 200 Mikroliter intrazellulären Fixationspuffer zu jedem Brunnen.Nach einer 30- bis 60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Proben per Zentrifugation sammeln und die Pellets in 200 Mikrolitern 1X Permeabilitätspuffer pro Brunnen wieder aufsetzen. Zentrifugieren Sie die Proben erneut und setzen Sie die Pellets nach dem Wegwerfen des Überstandes in 100 Mikrolitern mit frischem Permeabilisationspuffer wieder auf. Als nächstes fügen Sie die entsprechenden Antikörper für den Nachweis von intrazellulären Antigenen von Interesse für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu, die vor Licht geschützt sind.Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter 1X Permeabilisationspuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Proben durch Zentrifugation verdrehen. Dann setzen Sie die Fleckenzellen in 200 Mikroliter Nließzytometrie-Färbungspuffer wieder auf und analysieren die Zellen durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen. Ein typischer klinischer Verlauf von EAE sollte zu einer Krankheitskurve und einer Veränderung des Körpergewichts führen, wie dargestellt.C57BL/6 Mäuse, die mit MOG 35-55 geimpft wurden, beginnen in der Regel, Krankheitssymptome um Tag 10 bis 12 zu entwickeln und erreichen den Höhepunkt der Krankheit um Tag 15 bis 21. Vor dem Auftreten der Krankheit steigt das Körpergewicht von immunisierten Mäusen allmählich an, bevor sie in Korrelation mit den zunehmenden Krankheitssymptomen abnehmen. Die Mäuse zeigen das niedrigste Körpergewicht auf dem Höhepunkt der EAE, wobei sich die Körpergewichte leicht erholen, wenn die klinischen Symptome abnehmen. Die Mäuse erholen sich jedoch in der Regel nicht vollständig und entwickeln in der Regel eine monophasische chronische Krankheitspathologie.Wie diese repräsentative Strömungsanalyse zeigt, sind Interferon-Gamma-produzierende Th1- und IL17-produzierende Th17-Zellen bei EAE-Mäusen signifikant erhöht. Der wichtigste Schritt ist 3.10. Der Bediener sollte die mittlere Schicht und das Licht übertragen, vorsichtig, nehmen sie so wenig andere Schichten wie möglich.Nach diesem Protokoll können wir weitere T-Lymphozyten für weitere Transkriptionsanalysen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von ROS-Produktion In Makrophagen als Reaktion auf FcγR Vernetzung

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...