Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק (31570921 ל ZJ, 81571533 לLS), הוועדה העירונית של שנגחאי לבריאות, ותכנון משפחה (201540206 ל ZJ), Ruijin בית החולים צפון מענק מחקר (2017ZX01 ל ZJ).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת בעלי החיים של בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת שנגחאי Jiao טונג.
1. הכנת החומרים
<ol><li>השתמש ברצף MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK של MOG35-55 כדי להשיג את הפפטיד lyophilized ממקורות מסחריים. ודא כי טוהר הפפטיד הוא >95%. הכן 10 מ"ג/מ"ל MOG פתרון מניות בתמיסת מלח פו?...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

מחקר זה מציג פרוטוקול כדי לגרום ולפקח EAE באמצעות MOG35-55 בעכברים C57BL/6, אשר נחשבים מודל בעלי חיים ניסיוני נוירואימונולוגי טיפוסי של MS. EAE יכול להיות מושרה משתנה זנים עכברים או סוג של חלבון המשמש אינדוקציה על פי מטרת המחקר. לדוגמה, באמצעות PLP139-151 פפטיד בעכברים SJL יכול לגרום קורס מחלת EAE relapsing remitting ?...

כמחלה demyelinating כרונית של CNS, טרשת נפוצה משפיעה על 2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם וחסר טיפוליםמרפאים 1. הוא נחשב גם מחלה אוטואימונית, שבה לימפוציטים T אנטיגן מימין ספציפיים ליזום תגובה דלקתית ולהוביל demyelination ופציעה סקסונית ב CNS2. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) שימשה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים פתוגנים של טרשת נפוצה כמודל קלאסי מחלת דמיאליציה אוטואימונית ב CNS3. ישנן שתי דרכים לגרום EAE: אחת היא לגרום EAE באופן פעיל על ידי חיסון בעלי חיים עם רכיבים מילין, אחר הוא העברה מאמצת על ידי העברת תאי T encephalitogenic לתוךקולטן 2,,4,,5. הרגישות ל-EAE שונה בזני בעלי חייםשונים 6. בעכברים C57BL/6, מיטלין אוליגודנדרוציט גליקופרוטין (MOG) 35-55 אתגר גורם למחלה monophasic עם demyelination נרחב ודלקת ב-CNS, אשר משמש לעתים קרובות בניסויים עם עכברים ממוקדיםבגן 7.
הדור של תאי T תגובתיים ספציפיים מילין נדרש להתרחשות ופיתוח של מחלה בEAE והוא סימן חיסוני של EAE ו טרשת נפוצה. לימפוציטים T אוטומטי פעיל לחצות את מחסום מוח הדם (BBB) לתוך CNS בריא ליזום מחלת EAE. כאשר MOG 35-55 Ag נתקל, לימפוציטים T אלה לגרום לדלקת וגיוס של תאי אפקט לתוך CNS, וכתוצאה מכך demyelination והרס axon8,9. במודל EAE, יש ראיות רבות כי נוירואנטיגן ספציפי CD4+ T תאים יכולים ליזום ולקיים דלק עצבי ופתולוגיה3,,10. בהתאם ציטוקינים העיקריים המיוצרים, CD4+ T לימפוציטים סווגו לתוך קבוצות משנה שונות: Th1 (מאופיין בייצור של אינטרפרון-γ), Th2 (מאופיין בייצור של interleukin 4), ו Th17 (מאופיין בייצור של interleukin 17). הוא האמין כי ההפעלה של תאי Th1 ו Th17 לתרום אינדוקציה, תחזוקה, ורגולציה של demyelination דלקתי ב EAE ו טרשת נפוצה על ידי הפרשת ציטוקינות effector IFN-γ ו IL-17, אשר מסוגלים להפעיל מקרופאגים וגיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים כדי להאיץ אתהנגעים 11.
בגלל תאי T תגובה אוטומטית לחצות את BBB לתוך CNS ול לגרום להתפתחות המחלה ב-MS ו- EAE, חשוב מאוד לנתח תאי T ב-CNS. עם זאת, יש מעט מאוד פרוטוקולים מבוססים לבידוד של לימפוציטים מ CNS12. לכן, שיטה אופטימיזציה לבידוד תאים חד-נו-קוטריים מהמוח וניתוח לימפוציטים T עם סמנים CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g, ו IL-17 עבור ציתימטריית זרימה פותחה. השיטה משתמשת MOG35-55 adjuvant Mycobacterium שחפת H37 Ra ו פתרון עבודה רעלן Pertussis (PTX) כדי לגרום מודל חיסון פעיל של EAE בעכברים. לאחר מכן, שיטות צנטריפוגציה הדרגתית של הפרדה מכנית ושיפוע צפיפות משמשים לבידוד של תאים חד-נו-נו-קוטביים CNS. לבסוף, אסטרטגיה ממוטבת cytometry gating זרימה משמש כדי לזהות לימפוציטים T ותת קבוצות מהמוח על ידי הכתמת סמנים מרובים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הנגרמת על ידי שילוב של גורמים סביבתיים ורקע גנטי רגיש. אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הוא מודל מחלה טיפוסי של טרשת נפוצה בשימוש נרחב לחקירת הפתוגנזה שבה לימפוציטים T ספציפי לאנטיגנים מיאלינים ליזום תגובה דלקתית ב- CNS. חשוב מאוד להעריך כיצד לימפוציטים במערכת העצבים תסדיר את התפתחות המחלה. עם זאת, הגישה למדידת הכמות והאיכות של לימפוציטים חדרו ב-CNS מוגבלת מאוד בשל הקשיים בבידוד ואיתור לימפוציטים חדרו מהמוח. כתב יד זה מציג פרוטוקול לכך שימושי לבידוד, זיהוי, ואפיון של לימפוציטים הסתננו ממערכת העצבים הצרפתית ויהיה מועיל להבנתנו כיצד לימפוציטים מעורבים בפיתוח המחלה האוטואימונית CNS.

לאחר חיסון של עכברים C57BL/6, כל העכברים נשקלו, נבדקו, ותודרגו מדי יום עבור סימנים נוירולוגיים. הקורס הקליני המייצג של EAE צריך לגרום עקומת מחלה כפי שמוצג איור 2A ושינוי משקל הגוף בעכבר כפי שמוצג איור 2B. C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG35-55 בדרך כלל התחיל לפתח תסמיני מחלה ס?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן יעזור לנו להבין כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות המחלה האוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית. בשיטה זו, לימפוציטים במוח ניתן ללמוד על בסיס תא אחר תא. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מודלים אחרים ומחלות מערכת העצבים המרכזית כי צריך לנתח את המאפיינים והתפקודים של תאים חיסוניים.בסרטון זה, הפרוטוקול יכול בקלות להדגים כיצד לגרום למודל ולבודד תאים בודדים במוח. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, להשתמש מזרק אחד מיליליטר להזריק תת עורית C57BL/6 עכברים עם 100 מיקרוגרם של MOG אמולסיה 35-55 ב 100 microliters של הישבן המלא של פרוינד לשני אתרים שונים של הגב ליד הצוואר. באותו יום וביום השני לאחר החיסון, להזריק תוך-אפית את העכברים עם 200 microliters של ננוגרם אחד לכל פתרון רעלן שעלת microliter.לאחר הזריקה השנייה, מעבירים את העכברים בחזרה לכלוב הביתי שלהם עם כרית חימום וניטור עד לחזרה מלאה. למחרת ולאורך כל המחלה, בדקו ודרגו את כל העכברים בצורה עיוורת לסימנים הנוירולוגיים המתוארים בטבלה ולשינויים במשקל. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר ומעבירים את המוח של כל חיה מתיבת הגולגולת לצינורות בודדים של 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של מדיום RPMI.מערבבים היטב את הצינורות כדי להסיר את תאי הדם האדומים החסידים ולהסיר את המדיום על ידי שאיפה. מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום טרי לכל צינור ומעבירים את המוח למנות בודדות של 100 מילימטר. לבסוף קוצצים כל מוח עם סכין גילוח ולהשתמש פיפטה פלסטיק להעביר כמה שיותר רקמה מנה אחת בכל פעם ושישה מיליליטר של מדיום לתוך homogenizer זכוכית ממורכזת 7 מיליליטר.טוחנים את המוח באמצעות הבוכנה הרופפות של העלי לפני השימוש בבוכנה ההדוקה כדי להביא את הרקמה עד ההשעיה היא הומוגנית. לאחר מכן, יוצקים את תרחיף הרקמה וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר מקורר מראש על קרח. כאשר כל הדגימות כבר homogenized, להתאים את עוצמת הקול בכל צינור לשבעה מיליליטר עם מדיום טרי, לפני הוספת כל השעיית רקמה לצינור חדש מקורר 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של 100% מטריצת קרום מרתף לכל צינור.מערבבים על ידי היפוך כמה פעמים ולהשתמש פיפטה שלושה מיליליטר בזהירות ולאט לאט להוסיף מיליליטר אחד של 70 אחוז צפיפות פתרון הדרגתי תחת כל מדגם פתרון רקמה. להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ולהסיר כמעט את כל השכבה העליונה, דואג להסיר לחלוטין את כל המירילין. העבר את הממשק לתוך צינור חדש 15 מיליליטר ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 מיליליטר עם מדיום טרי.ואז צנטריפוגה הדגימות שוב ולהסיר את supernatant לפני resuspending כדורי בערך 100 microliters של בינוני לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של תאי המוח שנקטפו, להקצות בערך פעמיים 10 לשישה תאים ב 100 microliters של בינוני לתוך בארות בודדות של צלחת 96 באר. כאשר כל התאים כבר מצופים, להוסיף 100 microliters של קוקטייל גירוי תא 500X בתוספת מעכבי הובלת חלבון ל הבאר ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות.בסוף מאגר הדגירה התאים בתחתית בארות על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי ב 100 microliters של חיץ ציטומטריה זרימה לכל באר. מקדים את התאים עם שלושה מיקרוליטרים של בלוק CD16/CD32 נגד עכברים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הכתמה. כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות של Fc..בסוף הדגירה, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המעניין כל באר ומ מניחים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור. לאחר 30 דקות, לשטוף את בארות עם 100 microliters של חיץ cytometry זרימה לכל גם ומציעים את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת העל-טבעיים, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר קיבוע תאי לכל באר.לאחר דגירה של 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 200 microliters של חיץ חנוניות 1X ל הבאר. צנטריפוגה הדגימות שוב, ולאחר השלכת supernatant, resuspend כדורי ב 100 microliters עם חיץ permeabilization טרי. לאחר מכן, להוסיף את הנוגדנים המתאימים לגילוי של כל אנטיגנים תאיים של עניין עבור דגירה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של חיץ 1X permeabilization לכל באר ולסובב את הדגימות על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאי הכתם ב- 200 מיקרוליטרים של מאגר הכתמים של ציטומטריית זרימה ונתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. קורס קליני טיפוסי של EAE צריך לגרום עקומת מחלה ושינוי במשקל הגוף כפי שמודגם.C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG 35-55 בדרך כלל מתחילים לפתח תסמיני מחלה סביב היום 10 עד 12 ולהשיג את שיא המחלה סביב היום 15 עד 21. לפני הופעת המחלה, משקל הגוף של עכברים מחוסנים עולה בהדרגה לפני ירידה בקורלציה עם תסמיני המחלה הגוברת העכברים מדגימים את משקל הגוף הנמוך ביותר בשיא EAE, כאשר משקולות הגוף מתאוששות מעט ככל שהתסמינים הקליניים יורדים. העכברים בדרך כלל לא להתאושש באופן מלא עם זאת ובדרך כלל להמשיך לפתח פתולוגיה מחלה כרונית מונופאסיקית.כפי שממחיש ניתוח זרימה מייצג זה, תאי Th1 ו- Th17 המייצרים אינטרפרון גמא ו- IL17 גדלים באופן משמעותי בעכברי EAE. הצעד החשוב ביותר הוא 3.10. המפעיל צריך להעביר את השכבה האמצעית ואת האור, להיות בזהירות, לקחת כמה שכבות אחרות ככל האפשר.בעקבות פרוטוקולים אלה, אנו יכולים לקדם לימפוציטים T לניתוח שעתוק נוסף ללמוד

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) מושרה ניסויי אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) בעכברים C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...