Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना ग्रांट (31570921 से जेडजे, 81571533 को एलएस), शंघाई म्यूनिसिपल कमीशन ऑफ हेल्थ, एंड फैमिली प्लानिंग (201540206 से जेडजे), रुइजिन हॉस्पिटल नॉर्थ रिसर्च ग्रांट (2017ZX01 से जेडजे) को सपोर्ट मिला।

यहां वर्णित सभी तरीकों को स्कूल ऑफ बेसिक मेडिकल साइंसेज, शंघाई जियाओ टोंग यूनिवर्सिटी की एनिमल कमेटी ने मंजूरी दे दी है ।
1. सामग्री की तैयारी
<ol><li>वाणिज्यिक स्रोतों से ल्योफिलीकृत पेप्टाइड प...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

यह अध्ययन C57BL/6 चूहों में MOG35-55 का उपयोग करके EAE को प्रेरित करने और निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसे एमएस के एक विशिष्ट न्यूरोइम्यूनोलॉजिकल प्रायोगिक पशु मॉडल माना जाता है। EAE को चूहों ?...

सीएनएस की एक पुरानी डिमीलिनिंग बीमारी के रूप में, एमएस दुनिया भर में लगभग 2.5 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है और उपचारात्मक उपचार1का अभाव है। इसे एक ऑटोइम्यून बीमारी भी माना जाता है, जिसमें मायलिन एंटीजन विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं और सीएनएस 2 में डिमाइलेशन और एक्सोनल चोट का कारणबनतेहैं। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) का व्यापक रूप से सीएनएस3में एक क्लासिक ऑटोइम्यून डेमिलेशन रोग मॉडल के रूप में एमएस के रोगजनक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। ईएई को प्रेरित करने के दो तरीके हैं: एक यह है कि एनीमलिन घटकों के साथ जानवरों को प्रतिरक्षित करके सक्रिय रूप से ईएई को प्रेरित किया जाए, दूसरा एंसेप्लिनिक टी कोशिकाओं को,रिसेप्टर2,,4,5में स्थानांतरित करके दत्तक अंतरण है। ईएई के लिए संवेदनशीलता विभिन्न जानवरों के उपभेदों में भिन्न होती है6. C57BL/6 चूहों में, मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) 35-55 चैलेंज सीएनएस में व्यापक जनसांख्यिकी और सूजन के साथ एक मोनोफैसिक रोग को प्रेरित करता है, जो अक्सर जीन-लक्षित चूहों 7 के साथ प्रयोगों में उपयोग कियाजाताहै।
ईएई में रोग की घटना और विकास के लिए मायलिन-विशिष्ट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की पीढ़ी आवश्यक है और ईएई और एमएस दोनों का एक इम्यूनोलॉजिकल संकेत है। सक्रिय ऑटोरिएक्टिव टी लिम्फोसाइट्स स्वस्थ सीएनएस में रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार करते हैं और ईएई रोग शुरू करते हैं। जब एमओजी 35-55 एजी का सामना करना पड़ता है, तो ये टी लिम्फोसाइट्स सूजन और सीएनएस में प्रभावक कोशिकाओं की भर्ती को प्रेरित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिमाइलेशन और एक्सोन विनाश8,,9होता है। ईएई मॉडल में, इस बात के पर्याप्त सबूत हैं कि न्यूरोएंटीजेन-विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाएं न्यूरोइंफ्लेमेशन और पैथोलॉजी3,,10को शुरू और बनाए रख सकती हैं। उत्पादित प्रमुख साइटोकिन्स के आधार पर, सीडी 4+ टी लिम्फोसाइट्स को विभिन्न सबसेट में वर्गीकृत किया गया है: Th1 (इंटरफेरॉन-γ के उत्पादन की विशेषता), Th2 (इंटरल्यूकिन 4 के उत्पादन की विशेषता), और Th17 (इंटरल्यूकिन 17 के उत्पादन की विशेषता)। यह माना जाता है कि Th1 और Th17 कोशिकाओं की सक्रियता 11 घावों में तेजी लाने के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करने और भड़काऊ साइटों पर न्यूट्रोफिल की भर्ती करने में सक्षम हैं, जो प्रभावक साइटोकिन्स आईएफएन-γ और आईएल-17 को स्रावित करके ईएई और एमएस में भड़काऊ डिमिटिलेशन के प्रेरण, रखरखाव और विनियमन में योगदान देतीहै।
क्योंकि ऑटोरेक्टिव टी कोशिकाएं बीबीबी को सीएनएस में पार करती हैं और एमएस और ईएई में बीमारी के विकास को प्रेरित करती हैं, इसलिए सीएनएस में टी कोशिकाओं का विश्लेषण करना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, सीएनएस12से लिम्फोसाइट्स के अलगाव के लिए बहुत कम स्थापित प्रोटोकॉल हैं। इसलिए, मस्तिष्क से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मार्कर सीडी 45, सीडी 11बी, सीडी 3, सीडी 4, आईएनएफ-जी और आईएल-17 के साथ टी लिम्फोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित एक विधि विकसित की गई थी। इस विधि में चूहों में ईएई के सक्रिय प्रतिरक्षण मॉडल को प्रेरित करने के लिए MOG35-55 adjuvant Mycobacterium तपेदिक H37 Ra और Pertussis विष कार्य समाधान (PTX) का उपयोग करता है । फिर, सीएनएस मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए यांत्रिक पृथक्करण और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधियों का उपयोग किया जाता है। अंत में, एक अनुकूलित प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति का उपयोग कई मार्कर को धुंधला करके मस्तिष्क से टी लिम्फोसाइट्स और सबसेट की पहचान करने के लिए किया जाता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) पर्यावरणीय कारकों और अतिसंवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संयोजन के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक ऑटोइम्यून रोग है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) एमएस का एक विशिष्ट रोग मॉडल है जिसका व्यापक रूप से रोगजनकता की जांच के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें माइलिन एंटीजन के लिए विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स सीएनएस में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं। यह आकलन करना बहुत महत्वपूर्ण है कि सीएनएस में लिम्फोसाइट्स रोग के विकास को कैसे विनियमित करते हैं। हालांकि, सीएनएस में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स की मात्रा और गुणवत्ता को मापने के लिए दृष्टिकोण मस्तिष्क से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स को अलग करने और उनका पता लगाने में कठिनाइयों के कारण बहुत सीमित है। यह पांडुलिपि सीएनएस से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव, पहचान और लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी है और सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं, इसकी हमारी समझ के लिए उपयोगी होगी।

C57BL/6 चूहों के प्रतिरक्षण के बाद, सभी चूहों को तौला गया, जांच की गई और न्यूरोलॉजिकल संकेतों के लिए दैनिक वर्गीकृत किया गया । ईएई के प्रतिनिधि नैदानिक पाठ्यक्रम के परिणामस्वरूप एक रोग वक्र होना चाहिए जैसा ...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

यह पांडुलिपि चूहों में सक्रिय प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक विधि यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत की जाती है कि सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं।

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोयलाइटिस के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लिम्फोसाइट घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

हम यहां जो प्रोटोकॉल पेश करते हैं, वह हमारे लिए यह समझने में मददगार होगा कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं। इस विधि के साथ, मस्तिष्क में लिम्फोसाइट्स का अध्ययन कोशिका आधार द्वारा कोशिका पर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य मॉडलों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग पर भी लागू किया जा सकता है जिन्हें प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषताओं और कार्यों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।इस वीडियो में, प्रोटोकॉल आसानी से प्रदर्शित कर सकता है कि मॉडल को कैसे प्रेरित किया जाए और मस्तिष्क में एकल कोशिकाओं को अलग किया जाए। पेडल पलटा के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए चमड़े का ढंग से एनेस्थेटाइज्ड C57BL/6 चूहों के साथ पायसिफाइड MOG 35-55 के १०० माइक्रोलीटर में गर्दन के पास पीठ के दो अलग साइटों में पूर्ण Freund के adjuvant । एक ही दिन और दो पोस्टइम्यूनाइजेशन पर, इंट्रापेरिटोनेली चूहों को एक नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर पर्टुसिस टॉक्सिन वर्किंग सॉल्यूशन के 200 माइक्रोलीटर के साथ इंजेक्ट करता है।दूसरे इंजेक्शन के बाद, चूहों को एक वार्मिंग पैड और पूर्ण recumbency तक निगरानी के साथ अपने घर पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें। अगले दिन और रोग के दौरान, मेज में उल्लिखित न्यूरोलॉजिकल संकेतों के लिए और वजन में किसी भी परिवर्तन के लिए अंधा तरीके से चूहों की जांच और ग्रेड। उपयुक्त प्रायोगिक अंत बिंदु पर, नाक से गर्दन तक सावधानी से कपाल काटें और प्रत्येक जानवर के मस्तिष्क को कपाल बॉक्स से अलग-अलग 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें आरपीएमआई माध्यम के 10 मिलीलीटर होते हैं।ट्यूबों को अच्छी तरह से मिलाएं ताकि अनुयायी लाल रक्त कोशिकाओं को हटाया जा सके और आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दिया जा सके। प्रत्येक ट्यूब में ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और व्यक्तिगत 100 मिलीमीटर व्यंजनों में दिमाग स्थानांतरित करें। अंत में एक रेजर के साथ प्रत्येक मस्तिष्क काट और एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने के लिए एक समय में एक डिश से ज्यादा ऊतक के रूप में हस्तांतरण और एक आइसकोल्ड सात मिलीलीटर केंद्रित ग्लास समरूप में मध्यम के छह मिलीलीटर ।जब तक निलंबन सजातीय है ऊतक लाने के लिए तंग प्लंजर का उपयोग करने से पहले मूसल के ढीले प्लंजर का उपयोग कर मस्तिष्क पीसें। फिर, परिणामस्वरूप ऊतक घोल को बर्फ पर पूर्व-ठंडा 15 मिलीलीटर शंकु नली में डालें। जब सभी नमूनों को समरूप किया गया है, ताजा माध्यम के साथ सात मिलीलीटर के लिए प्रत्येक ट्यूब में मात्रा समायोजित, एक नया ठंडा 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रत्येक ऊतक निलंबन जोड़ने से पहले ट्यूब प्रति ट्यूब १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के तीन मिलीलीटर युक्त ।कई बार उलटा करके मिलाएं और ध्यान से तीन मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे प्रत्येक ऊतक समाधान नमूने के तहत 70 प्रतिशत घनत्व ढाल समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें। घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को अलग करें और लगभग सभी शीर्ष परत को हटा दें, ध्यान रखें कि सभी माइलिन को पूरी तरह से हटा दें। इंटरफ़ेस को एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और ताजा माध्यम के साथ वॉल्यूम को 10 मिलीलीटर में समायोजित करें।फिर नमूनों को फिर से अपकेंद्री करें और प्रति ट्यूब मध्यम के लगभग 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करने से पहले सुपरनेट को हटा दें। काटा मस्तिष्क कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, एक ९६-अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में मध्यम के १०० माइक्रोलीटर में छह कोशिकाओं के लिए लगभग दो बार 10 आवंटित । जब सभी कोशिकाओं को चढ़ाया गया है, तो 500X सेल उत्तेजना कॉकटेल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और कुओं में प्रोटीन परिवहन अवरोधक और प्लेट को चार घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।इनक्यूबेशन पूल के अंत में अपकेंद्रित्र द्वारा कुओं के तल पर कोशिकाओं और प्रवाह साइटोमेट्री बफर प्रति अच्छी तरह से १०० माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च । एंटी-माउस सीडी16/सीडी32 एफसी ब्लॉक के तीन माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को धुंधला होने से पहले चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूर्व-इनक्यूबेट करें । किसी भी गैर-विशिष्ट एफसी-मध्यस्थता बातचीत को अवरुद्ध करने के लिए।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से ब्याज की एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रखें। 30 मिनट के बाद, कुओं को प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 100 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को तलछट दें। सुपरनेटेंट को त्यागने के बाद, प्रत्येक कुएं में इंट्रासेलुलर फिक्सेशन बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा नमूनों को इकट्ठा करें और 1X पारगम्यता बफर प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। नमूनों को फिर से अपकेंद्री करें, और सुपरनेट को त्यागने के बाद, ताजा परमीबिलाइजेशन बफर के साथ 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। इसके बाद, प्रकाश से सुरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए ब्याज के किसी भी इंट्रासेलुलर एंटीजन का पता लगाने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में 1X पारमेबिलाइजेशन बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा नमूनों को स्पिन करें। फिर, फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर में दाग कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें। EAE के एक ठेठ नैदानिक पाठ्यक्रम के परिणामस्वरूप रोग वक्र और शरीर के वजन में परिवर्तन होना चाहिए जैसा कि सचित्र है।C57BL/6 चूहों MOG 35-55 के साथ प्रतिरक्षित आमतौर पर 10 से 12 दिन के आसपास रोग के लक्षण विकसित करने के लिए और 15 से 21 दिन के आसपास रोग के शिखर को प्राप्त करने के लिए शुरू करते हैं । रोग की शुरुआत से पहले, प्रतिरक्षित चूहों के शरीर का वजन धीरे-धीरे बढ़ती बीमारी के लक्षणों के साथ संबंध में कम होने से पहले बढ़ता है चूहों EAE के चरम पर सबसे कम शरीर के वजन का प्रदर्शन, शरीर के वजन के साथ थोड़ा ठीक होने के साथ नैदानिक लक्षण कम हो जाते हैं । चूहे आमतौर पर पूरी तरह से ठीक नहीं होते हैं और आमतौर पर मोनोफेसिक क्रोनिक डिजीज पैथोलॉजी विकसित करने के लिए जाते हैं।जैसा कि यह प्रतिनिधि प्रवाह विश्लेषण दिखाता है, इंटरफेरॉन गामा-उत्पादन Th1 और IL17-उत्पादक Th17 कोशिकाओं को EAE चूहों में काफी वृद्धि हुई है। सबसे महत्वपूर्ण कदम 3.10 है। ऑपरेटर को मध्य परत और प्रकाश को स्थानांतरित करना चाहिए, ध्यान से, कुछ अन्य परतों के रूप में संभव के रूप में लेना चाहिए।इन प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हम अध्ययन करने के लिए आगे ट्रांसक्रिप्शन विश्लेषण के लिए टी लिम्फोसाइट्स को आगे कर सकते हैं

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

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प्रायोगिक Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) प्रतिरोधी माउस खींच में दत्तक स्थानांतरण और प्रतिजनी चैलेंज के द्वारा पर काबू पाने unresponsiveness

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

नवजात और वयस्क केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र से संवर्धन Microglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL 6 / चूहों में प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis (EAE) प्रेरित

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

चूहे और विभिन्न ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रोग-निर्भर वितरण के मूल्यांकन में प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis की प्रेरण

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

कण-बाउंड बेट वी PM10 में 1 allergen के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

सरल और कुशल उत्पादन और माउस Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन की शुद्धि प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis अध्ययन के लिए

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

मानव पूरे रक्त में प्राकृतिक हत्यारा सेल Lytic गतिविधि का प्रवाह cytometric विश्लेषण

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

fcγr पार जोड़ने के जवाब में मैक्रोफेज में ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric माप

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को Intranasal siRNA वितरण के दौरान चूहे की नियुक्ति के लिए एक पोजिशनिंग डिवाइस

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...