Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (31570921 a ,J, 81571533 a LS), dalla Commissione Municipale di Pianificazione Della Salute di Shanghai e dalla Pianificazione Familiare (201540206 a J), dalla sovvenzione per la ricerca del Ruijin Hospital North (dal 2017 alla J).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato animali della Scuola di Scienze Mediche Di Base, Shanghai Jiao Tong University.
1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Utilizzare la sequenza MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK di MOG35–55 per ottenere il peptide liofilizzato da fonti commerciali. Assicurarsi che la purezza del peptide sia >95%. Preparare la soluzione di stock MOG da 10 mg/mL in una salina tamponata di fosfati (PBS) e conservarla a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare u...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Questo studio presenta un protocollo per indurre e monitorare l'EAE utilizzando MOG35-55 nei topi C57BL/6, che sono considerati un tipico modello animale sperimentale neuroimmunico della MS. Ad esempio, l'uso di peptidi PLP139–151 nei topi SJL può indurre un corso di malattia EAE recidivante che è particolarmente adatto per valutare gli effetti terapeutici sulle ricadute15. La procedura sperimentale qui descritta può essere applicata anche ad altri protocolli EAE7. In ...

Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi1. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell'antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC2. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS3. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attivamente immunizzando gli animali con componenti mielin, un altro è il trasferimento adottivo trasferendo le cellule T encefalogeniche nelrecettore 2,4,5. Le suscettibilità a EAE sono diverse in diversi ceppi animali6. Nei topi C57BL/6, la glicoproteina mielina oligodendrocite (MOG) 35-55 induce una malattia monofasica con estatissima demelinazione e infiammazione nel SNC, che viene spesso utilizzata negli esperimenti con topi gene-mirati7.
La generazione di cellule T reattive specifiche della mielina è necessaria per l'insorgenza e lo sviluppo della malattia nell'EAE ed è un segno immunologico sia di EAE che di SM. I linfociti T autoreattivi attivati attraversano la barriera ematica del cervello (BBB) nel SNC sano e avviano la malattia EAE. Quando si incontra MOG 35-55 Ag, questi linfociti T inducono infiammazione e il reclutamento di cellule estruse nel SNC, con conseguente demielinazione e distruzione dell'assone8,9. Nel modello EAE, ci sono ampie prove che le cellule CD4 specifiche del neuroantigenopossono avviare e sostenere la neuroinfiammazione e lapatologia 3,10. A seconda delle principali citochine prodotte, i linfocitiCD4 e T sono stati classificati in diversi sottoinsiemi: Th1 (caratterizzato dalla produzione di interferone-γ), Th2 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 4) e Th17 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 17). Si ritiene che l'attivazione delle cellule Th1 e Th17 contribuisca all'induzione, al mantenimento e alla regolazione della demistelinazione infiammatoria in EAE e MS secernendo le citochine effettore IFN-γ e IL-17, che sono in grado di attivare macrofagi e reclutare neutroni nei siti infiammatori per accelerare le lesioni11.
Poiché le cellule T autoreattive attraversano il BBB nel SNC e inducono lo sviluppo della malattia nella SM e nell'EAE, è molto importante analizzare le cellule T nel SNC. Tuttavia, ci sono pochissimi protocolli stabiliti per l'isolamento dei linfociti dal CNS12. Pertanto, è stato sviluppato un metodo ottimizzato per isolare le cellule mononucleari dal cervello e analizzare i linfociti T con marcatori CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 per la citometria di flusso. Il metodo utilizza MOG35-55 adiuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra e Pertussis Toxin Working Solution (PTX) per indurre un modello di immunizzazione attiva di EAE nei topi. Quindi, i metodi di separazione meccanica e di centrifugazione del gradiente di densità vengono utilizzati per l'isolamento delle cellule mononucleari CNS. Infine, viene utilizzata una strategia ottimizzata di gating della citometria del flusso per identificare i linfociti T e i sottoinsiemi dal cervello colorando più marcatori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

La sclerosi multipla (MS) è una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) causata dalla combinazione di fattori ambientali e background genetico suscettibile. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello tipico di malattia della SM ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi in cui i linfociti T specifici per gli antigeni della mielina avviano una reazione infiammatoria nel SNC. È molto importante valutare come i linfociti nel SNC regolano lo sviluppo della malattia. Tuttavia, l'approccio per misurare la quantità e la qualità dei linfociti infiltrati nel SNC è molto limitato a causa delle difficoltà nell'isolare e rilevare i linfociti infiltrati dal cervello. Questo manoscritto presenta un protocollo per che è utile per l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati dal SNC e sarà utile per la nostra comprensione di come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Dopo l'immunizzazione dei topi C57BL/6, tutti i topi sono stati pesati, esaminati e classificati quotidianamente per segni neurologici. Il corso clinico rappresentativo di EAE dovrebbe provocare una curva della malattia come presentato nella Figura 2A e un cambiamento del peso corporeo nel topo come presentato nella figura 2B. I topi C57BL/6 immunizzati con MOG35-55 di solito hanno iniziato a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e hanno raggiun...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Il protocollo che presentiamo qui ci sarà utile per capire come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del sistema nervoso centrale. Con questo metodo, i linfociti nel cervello possono essere studiati su base cellulare. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri modelli e malattie del sistema nervoso centrale che dovevano analizzare le caratteristiche e le funzioni delle cellule immunitarie.In questo video, il protocollo può facilmente dimostrare come indurre il modello e isolare singole cellule nel cervello. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, utilizzare una siringa millilitro per iniettare per via sottocutanea topi C57BL/6 anestetizzati con 100 microgrammi di MOG 35-55 emulsionati in 100 microlitri di coadiuvante completo di Freund in due diversi siti della schiena vicino al collo. Lo stesso giorno e il secondo giorno di postimmunizzazione, iniettare per via intraperitoneale i topi con 200 microlitri di un nanogrammo per soluzione di lavoro di tossine per microliter pertosse.Dopo la seconda iniezione, trasferire i topi nella gabbia di casa con un tampone riscaldante e il monitoraggio fino alla piena rimiglia. Il giorno successivo e durante tutto il corso della malattia, esaminare e classificare tutti i topi in modo accecato per i segni neurologici delineati nella tabella e per eventuali cambiamenti di peso. All'endpoint sperimentale appropriato, tagliare accuratamente il cranio dal naso al collo e trasferire il cervello di ogni animale dalla scatola cranale in singoli tubi da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di mezzo RPMI.Mescolare bene i tubi per rimuovere i globuli rossi aderenti e rimuovere il mezzo per aspirazione. Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco ad ogni tubo e trasferire il cervello in singoli piatti da 100 millimetri. Infine tritare ogni cervello con un rasoio e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire tanto tessuto da un piatto alla volta e sei millilitri di mezzo in un omogeneizzatore di vetro centrato su sette millilitri ghiacciato.Macinare il cervello usando lo stantuffo sciolto del pestello prima di utilizzare lo stantuffo stretto per portare il tessuto fino a quando la sospensione non è omogenea. Quindi, versare il liquame tissutale risultante in un tubo conico pre-refrigerato da 15 millilitri sul ghiaccio. Una volta omogeneizzati tutti i campioni, regolare il volume in ogni tubo a sette millilitri con mezzo fresco, prima di aggiungere ogni sospensione tissutale a un nuovo tubo refrigerato da 15 millilitri contenente tre millilitri di matrice di membrana basale al 100% per tubo.Mescolare per inversione un paio di volte e utilizzare una pipetta da tre millilitri per aggiungere con attenzione e lentamente un millilitro di soluzione gradiente di densità del 70% sotto ogni campione di soluzione tissutale. Separare le cellule per centrifugazione gradiente di densità e rimuovere quasi tutto lo strato superiore, facendo attenzione a rimuovere completamente tutta la mielina. Trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo da 15 millilitri e regolare il volume a 10 millilitri con mezzo fresco.Quindi centrifugare nuovamente i campioni e rimuovere il supernatante prima di rimescolare il pellet in circa 100 microlitri di mezzo per tubo. Per l'analisi citometrica del flusso delle cellule cerebrali raccolte, allocare circa due volte 10 alle sei cellule in 100 microlitri di mezzo in singoli pozzi di una piastra di 96 pozza. Quando tutte le cellule sono state placcate, aggiungere 100 microlitri di cocktail di stimolazione cellulare 500X più inibitori del trasporto proteico ai pozzi e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore.Alla fine del pool di incubazione le cellule nella parte inferiore dei pozzi per centrifugazione e rimorsi i pellet in 100 microlitri di tampone di citometria a flusso per pozzo. Pre-incubare le cellule con tre microlitri di Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block per 10 minuti a quattro gradi Celsius prima della colorazione. Per bloccare eventuali interazioni mediate da Fc non specifiche.Alla fine dell'incubazione, aggiungere il cocktail anticorpale di interesse per ogni pozzo e posizionare il piatto a quattro gradi Celsius protetto dalla luce. Dopo 30 minuti, lavare i pozzi con 100 microlitri di tampone di citometria di flusso per pozzo e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver scartato i supernatanti, aggiungere 200 microlitri di tampone di fissazione intracellulare ad ogni pozzo.Dopo un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente, raccogliere i campioni per centrifugazione e rimossare i pellet in 200 microlitri di tampone di permeabilità 1X per pozzo. Centrifugare nuovamente i campioni e, dopo aver scartato il supernatante, rimescolare il pellet in 100 microlitri con tampone di permeabilizzazione fresco. Successivamente, aggiungere gli anticorpi appropriati per il rilevamento di eventuali antigeni intracellulari di interesse per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce.Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione 1X ad ogni pozzo e far girare i campioni per centrifugazione. Quindi, rimospendare le cellule di macchia in 200 microlitri di buffer di colorazione citometria del flusso e analizzare le cellule per citometria del flusso secondo protocolli standard. Un tipico decorso clinico dell'EAE dovrebbe comportare una curva della malattia e un cambiamento del peso corporeo come illustrato.I topi C57BL/6 immunizzati con MOG 35-55 di solito iniziano a sviluppare sintomi di malattia intorno al giorno 10-12 e raggiungono il picco della malattia intorno al giorno 15-21. Prima dell'inizio della malattia, il peso corporeo dei topi immunizzati aumenta gradualmente prima di diminuire in correlazione con l'aumento dei sintomi della malattia I topi dimostrano il peso corporeo più basso al picco dell'EAE, con il peso corporeo che si riprende leggermente man mano che i sintomi clinici diminuiscono. I topi di solito non si riprendono completamente tuttavia e in genere sviluppano una patologia della malattia cronica monofasica.Come illustrato da questa analisi rappresentativa del flusso, le cellule Th1 e Th17 produttrici di gamma di interferone e produttrici di IL17 sono significativamente aumentate nei topi EAE. Il passo più importante è 3.10. L'operatore deve trasferire lo strato intermedio e la luce, essendo attentamente, prendere il minor numero possibile di altri strati.Seguendo questi protocolli, possiamo ulteriori linfociti T per ulteriori analisi di trascrizione per studiare

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

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A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...