Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
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이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(31570921 ~ZJ, 81571533 ~ LS), 상하이 시 보건위원회 및 가족 계획 (201540206 ~ ZJ), 루이진 병원 노스 연구 보조금 (2017ZX01 )

여기에 설명된 모든 방법은 상하이 자오퉁 대학교 기초의학대학의 동물위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 재료의 준비
<ol><li>MOG35-55의 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 서열을 사용하여 상업적 인 공급원으로부터 리오필화 펩티드를 얻습니다. 펩티드의 순도가 >95%인지 확인합니다. 인산염 완충식식염(PBS)에 10 mg/mL MOG 스톡 용액을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.</li>
	<li>M. 결핵 H37 Ra의 ...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

본 연구는 C57BL/6 마우스에서 MOG35-55를 사용하여 EAE를 유도하고 모니터링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 EAE MS의 전형적인 신경면역 실험 동물 모델로 간주되는 것으로 간주되어 연구의 목적에 따라 유도에 사용되는 마우스 균주 또는 단백질의 종류를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, SJL 마우스에서 PLP139-151 펩티드를 사용하면 재발에 대한 치료 효과를 평가하기에 특히 적합한 재발-방출 EAE 질병 과?...

CNS의 만성 탈근질환으로서 MS는 전 세계적으로 약 250만 명에게 영향을 미치고 치료 치료1이부족하다. 또한 골수린 항원 특이적 T 림프구가 염증 반응을 시작하고 CNS2에서탈량 및 축산 손상을 유도하는 자가 면역 질환으로 간주됩니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 CNS3에서고전적인 자가면역 탈생 질환 모델로서 MS의 병원성 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용되고 있다. EAE를 유도하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 하나는 골린 성분으로 동물을 예방 접종함으로써 EAE를 적극적으로 유도하는 것입니다, 또 다른 하나는 뇌성 T 세포를 수용체2,,4,,5로이송하여 입양 전달이다. EAE에 대한 감수성은 다른 동물 균주6에서다릅니다. C57BL/6 마우스에서, myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 35-55 도전은 유전자 표적 마우스를 가진 실험에서 빈번하게 이용되는 CNS에 있는 광대한 탈근 및 염증을 가진 단면질환을 유도합니다7.
골린 특이적 반응성 T 세포의 생성은 EAE에서 질병의 발생 및 발달에 필요하며 EAE와 MS. 활성화 된 자동 반응성 T 림프구가 건강한 CNS로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하고 EAE 질병을 개시하는 면역 징후입니다. MOG 35-55 Ag가 발생하면, 이러한 T 림프구는 염증과 이펙터 세포의 모집을 CNS로 유도하여 탈근및 축축 파괴8,,9의결과이다. EAE 모델에서는 신경항원 특이적CD4+ T 세포가 신경염증 및 병리학3,,10을시작하고 유지할 수 있다는 충분한 증거가 있다. 생산된 주요 사이토카인에 따라 CD4+ T 림프구는 다른 하위 집합으로 분류되었습니다: Th1 (인터페론 γ 생산 특징), Th2 (인터류킨 4의 생산 특징), Th17 (인터류킨 17의 생산에 의해 특징). Th1 과 Th17 세포의 활성화는 대식세포 활성화 및 염증 부위에 호중구를 모집할 수 있는 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17을 분비함으로써 EAE 및 MS의 염증성 탈생의 유도,11유지 및 조절에 기여하는 것으로 여겨진다.
자동 반응성 T 세포가 CBB를 CNS로 교차하고 MS 및 EAE에서 질병의 발달을 유도하기 때문에 CNS에서 T 세포를 분석하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS12로부터림프구의 분리를 위한 확립된 프로토콜은 거의 없다. 따라서, 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 마커 CD45, CD3, CD4, INF-g 및 IL-17을 사용하여 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 T 림프구를 분석하는 데 최적화된 방법이 개발되었다. 이 방법은 MOG35-55 보조 균 결핵 H37 라와 백혈구 독소 작업 용액 (PTX)을 사용하여 마우스에서 EAE의 활성 예방 접종 모델을 유도합니다. 이어서, 기계적 분리 및 밀도 그라데이션 원심분리 방법은 CNS 단핵세포의 분리를 위해 사용된다. 마지막으로, 최적화된 유동 세포측정 게이팅 전략은 여러 마커를 염색하여 뇌에서 T 림프구와 하위 집합을 식별하는 데 사용됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

다발성 경화증 (MS)은 환경 적 요인과 취약한 유전 배경의 조합으로 인한 중추 신경계 (CNS)의 자가 면역 질환입니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 MYelin 항원특이적 T 림프구가 CNS에서 염증 반응을 개시하는 병원발생을 조사하는 데 널리 사용되는 MS의 전형적인 질병 모델이다. CNS의 림프구가 질병의 발달을 어떻게 조절하는지 평가하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS에서 침투된 림프구의 양과 품질을 측정하는 접근법은 뇌에서 침투된 림프구를 분리하고 검출하는 데 어려움이 있기 때문에 매우 제한적이다. 이 원고는 CNS에서 침투된 림프구의 격리, 식별 및 특성화에 유용하며 림프구가 CNS 자가 면역 질환의 개발에 어떻게 관여하는지에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다.

C57BL/6 마우스의 예방 접종 후, 모든 마우스는 신경 징후를 위해 매일 계량, 검사 및 등급이 매겨졌습니다. EAE의 대표적인 임상 과정은 도 2B에제시된 바와 같이 도 2A에 제시된 질병 곡선과 마우스내 체중의 변화를 초래한다. MOG35-55로 예방접종된 C57BL/6 마우스는 보통 10~12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작했고, 활성 예방접종 후 15~21일 경에 질병의 피크...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

우리가 여기에서 제시하는 프로토콜은 우리가 림프구가 중앙 신경계 자기 면역 질병의 발달에 어떻게 관련되는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법으로, 두뇌에 있는 림프구는 세포 기초에 의해 세포에서 공부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 면역 세포의 특성 그리고 기능을 분석하는 데 필요한 그밖 모형 및 중추신경계 질병에 적용될 수 있습니다.이 비디오에서 프로토콜은 뇌의 단일 세포를 모델링유도하고 격리하는 방법을 쉽게 입증할 수 있습니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 피하 마취 C57BL / 6 마우스를 피하 주입하기 위해 1 밀리리터 주사기를 사용하여 100 마이크로 그램의 유화 MOG 35-55에 완전한 Freund의 보조제의 100 마이크로 리터는 목 근처의 두 개의 다른 부위에 주입하십시오. 같은 날과 둘째 날, 마이크로리터 등리소 작업 용액당 1나노그램의 200마이크로리터를 마우스에 내분한다.두 번째 주사 후, 온난화 패드와 함께 자신의 홈 케이지에 다시 마우스를 전송하고 전체 recumncy까지 모니터링. 다음날 및 질병의 과정을 통해, 검사 및 테이블에 설명 된 신경 징후와 체중의 변화에 대한 맹목적인 방식으로 모든 마우스를 등급. 적절한 실험 적 종점에서, 코에서 목으로 두개골을 신중하게 잘라 RPMI 매체의 10 밀리리터를 포함하는 개별 50 밀리리터 튜브로 각 동물의 뇌를 전송.튜브를 잘 섞어 부착된 적혈구를 제거하고 포부로 배지를 제거합니다. 각 튜브에 10 밀리리터의 신선한 매체를 추가하고 뇌를 개별 100밀리미터 요리로 옮킨다. 마지막으로 면도기로 각 뇌를 자르고 플라스틱 파이펫을 사용하여 한 번에 한 접시에서 많은 조직을 옮기고 6 밀리리터의 중간 밀리리터를 얼음처럼 차가운 7 밀리리터 중심의 유리 균질화로 옮춥춥시다.서스펜션이 균일할 때까지 조직을 가져오기 위해 단단한 플런저를 사용하기 전에 페일의 느슨한 플런저를 사용하여 뇌를 갈아. 그런 다음, 얼음에 미리 차가운 15 밀리리터 원추형 튜브에 결과 조직 슬러리를 부어. 모든 시료가 균질화되면 각 튜브의 부피를 신선한 배지로 7 밀리리터로 조정한 후 각 조직 현탁액을 튜브 당 100% 지하 막 매트릭스 3밀리리터를 포함하는 새로운 냉장 15 밀리리터 튜브에 추가합니다.반전을 몇 번 혼합하고 3 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 조직 용액 샘플 아래에 70% 밀도 그라데이션 용액의 1밀리리터를 신중하게 천천히 추가합니다. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 거의 모든 상단 층을 제거하여 모든 myelin을 완전히 제거합니다. 인터페이스를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 신선한 배지로 10 밀리리터로 볼륨을 조정합니다.그런 다음 샘플을 다시 원심 분리하고 침투체를 제거한 후 튜브 당 약 100 마이크로리터의 중간 마이크로리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 수확된 뇌 세포의 유동 세포 측정 분석을 위해, 배지의 100 마이크로리터에 있는 6개의 세포에 대략 2회 10을 96웰 플레이트의 개별 우물으로 할당합니다. 모든 세포가 도금되면 500X 세포 자극 칵테일의 100 마이크로리터와 단백질 수송 억제제를 우물에 추가하고 4시간 동안 세포 배양 배양 배양에 플레이트를 배치합니다.인큐베이션 풀의 끝에서 원심분리에 의해 우물 의 바닥에 있는 세포를 잘 당 유동 세포 분석 버퍼의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 염색하기 전에 섭씨 4도에서 10 분 동안 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 블록의 3 개의 마이크로 리터로 세포를 사전 배양하십시오. 특정하지 않은 Fc 매개 상호 작용을 차단합니다.인큐베이션이 끝나면 각 우물에 관심있는 항체 칵테일을 추가하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 접시를 놓습니다. 30 분 후, 우물당 100 마이크로 리터의 유동 세포측정 완충제로 우물을 씻고 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다. 수퍼넌츠를 폐기한 후 각 웰에 세포 내 고정 버퍼 200 마이크로리터를 추가합니다.실온에서 30~60분 간 배양한 후, 원심분리로 샘플을 수집하고 우물당 1X 투과성 버퍼의 200마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 원심 분리시 시료를 다시 한번 제거하고, 상퍼를 버린 후, 신선한 투과화 버퍼로 100 마이크로리터에서 펠릿을 재차 분리한다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 30분 동안 관심 있는 세포내 항원 검출을 위한 적절한 항체를 추가한다.인큐베이션이 끝나면 각 웰에 1X 투과화 버퍼의 100 마이크로리터를 추가하고 원심분리로 시료를 스핀다운합니다. 이어서, 유동 세포분석 염색 버퍼의 200 마이크로리터에서 얼룩 세포를 재중단하고 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 세포를 분석한다. EAE의 전형적인 임상 과정은 그림과 같이 질병 곡선과 체중의 변화를 초래한다.MOG 35-55로 면역화된 C57BL/6 마우스는 일반적으로 10일에서 12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작하고 15일에서 21일 경에 질병의 피크를 달성한다. 질병의 발병 전에, 면역 마우스의 체중은 점차 증가 질병 증상과 상관 관계감소하기 전에 증가- 마우스는 EAE의 피크에 가장 낮은 체중을 입증, 임상 증상이 감소함에 따라 체중이 약간 회복. 마우스는 일반적으로 그러나 완전히 복구하지 않으며 전형적으로 단면 만성 질병 병리를 개발하기 위하여 계속합니다.이러한 대표적인 유동 분석에서 알 수 있듯이, 인터페론 감마 생산 Th1 및 IL17 생산 Th17 세포는 EAE 마우스에서 현저히 증가한다. 가장 중요한 단계는 3.10입니다. 연산자는 중간 레이어와 빛을 조심스럽게 옮기고 가능한 한 적은 다른 레이어를 수행해야 합니다.이러한 프로토콜에 따라, 우리는 추가 전사 분석을 위해 추가 T 림프구를 추가로 연구할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

연구

면역학 및 감염병학

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...