Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China stipend (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, og Familieplanlegging (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningsstipend (2017ZX01 til ZJ).

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av dyrekomiteen ved School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Utarbeidelse av materialene
<ol><li>Bruk MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 for å få lyofilisert peptid fra kommersielle kilder. Kontroller at renheten på peptiden er >95%. Forbered 10 mg/ml MOG lageroppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS) og oppbevar ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered en 4 mg/ml lagerløsning av M. tuberkulose H37...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Denne studien presenterer en protokoll for å indusere og overvåke EAE ved hjelp av MOG35-55 i C57BL/6 mus, som regnes som en typisk nevroimmunologisk eksperimentell dyremodell av MS. EAE kan induseres varierende musstammer eller type protein som brukes til induksjon i henhold til formålet med studien. For eksempel kan bruk av PLP139-151 peptid hos SJL-mus indusere et residerende remitteringskurs for EAE-sykdom som er spesielt egnet for å vurdere terapeutiske effekter på tilbakefall15. Den eks...

Som en kronisk demyeliniserende sykdom i CNS påvirker MS ca. 2,5 millioner mennesker over hele verden og mangler kurative behandlinger1. Det regnes også som en autoimmun sykdom, hvor myelinantigenspesifikke T-lymfocytter initierer en inflammatorisk reaksjon og fører til demyelinasjon og axonal skade i CNS2. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) har blitt mye brukt til å undersøke patogene mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelinasjonssykdomsmodell i CNS3. Det er to måter å indusere EAE: en er å indusere EAE aktivt ved å immunisere dyr med myelinkomponenter, en annen er adoptivoverføring ved å overføre encefalitogene T-celler tilreseptor 2,,4,,5. Følsomheten for EAE er forskjellige i forskjellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus induserer myelin oligodendrocyttglykoprotein (MOG) 35–55-utfordring en monofasisk sykdom med omfattende demyelinasjon og betennelse i CNS, som ofte brukes i eksperimenter med genmålrettede mus7.
Genereringen av myelinspesifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og utvikling av sykdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverte autoreaktive T-lymfocytter krysser blodhjernsbarrieren (BBB) inn i den sunne CNS og initierer EAE-sykdommen. Når MOG 35–55 Ag oppstår, induserer disse T-lymfocytene betennelse og rekruttering av effektorceller til CNS, noe som resulterer i demyelinasjon og aksonødeleggelse8,9. I EAE-modellen er det rikelig med bevis for at nevroantigenspesifikke CD4+ T-celler kan initiere og opprettholde nevroinflammasjon og patologi3,10. Avhengig av de store cytokinene som produseres, har CD4+ T-lymfocytter blitt klassifisert i forskjellige undergrupper: Th1 (preget av produksjon av interferon-γ), Th2 (preget av produksjon av interleukin 4), og Th17 (preget av produksjon av interleukin 17). Det antas at aktivering av Th1 og Th17 celler bidra til induksjon, vedlikehold og regulering av inflammatorisk demyelination i EAE og MS ved å skille ut effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til å aktivere makrofager og rekruttere nøytrofiler til de inflammatoriske stedene for å akselererelesjonene 11.
Fordi autoreaktive T-celler krysser BBB inn i CNS og induserer utviklingen av sykdom i MS og EAE, er det svært viktig å analysere T-celler i CNS. Det er imidlertid svært få etablerte protokoller for isolering av lymfocytter fra CNS12. Derfor ble en metode optimalisert for å isolere mononukleære celler fra hjernen og analysere T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for strømningscytometri utviklet. Metoden bruker MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra og Pertussis Toxin Working Solution (PTX) for å indusere en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos mus. Deretter brukes mekanisk separasjon og tetthet gradient sentrifugeringsmetoder for isolering av CNS mononukleære celler. Til slutt brukes en optimalisert strømningscytometri gating strategi for å identifisere T-lymfocytter og undergrupper fra hjernen ved å farge flere markører.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multippel sklerose (MS) er en autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) forårsaket av kombinasjonen av miljøfaktorer og mottakelig genetisk bakgrunn. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en typisk sykdomsmodell av MS som er mye brukt til å undersøke patogenesen der T-lymfocytter spesifikke for myelinantigener initierer en inflammatorisk reaksjon i CNS. Det er svært viktig å vurdere hvordan lymfocytter i CNS regulerer utviklingen av sykdommen. Imidlertid er tilnærmingen for å måle mengden og kvaliteten på infiltrerte lymfocytter i CNS svært begrenset på grunn av vanskelighetene med å isolere og oppdage infiltrerte lymfocytter fra hjernen. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for det som er nyttig for isolasjon, identifisering og karakterisering av infiltrerte lymfocytter fra CNS og vil være nyttig for vår forståelse av hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Etter immunisering av C57BL/6-mus ble alle mus veid, undersøkt og gradert daglig for nevrologiske tegn. Det representative kliniske løpet av EAE bør resultere i en sykdomskurve som presentert i figur 2A og en endring av kroppsvekt i musen som presentert i figur 2B. C57BL/6-mus immunisert med MOG35-55 begynte vanligvis å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10–12 og oppnådde sykdomstoppen rundt dag 15–21 etter aktiv immunisering (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å indusere aktiv eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) hos mus. En metode for isolasjon og karakterisering av infiltrerte lymfocytter i sentralnervesystemet (CNS) presenteres også for å vise hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Protokollen vi presenterer her vil være nyttig for oss å forstå hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av sentralnervesystemet autoimmun sykdom. Med denne metoden kan lymfocytter i hjernen studeres på cellebasis. Denne protokollen kan også brukes på andre modeller og sentralnervesystemet sykdom som trengs for å analysere egenskapene og funksjonene til immunceller.I denne videoen kan protokollen enkelt demonstrere hvordan man induserer modell og isolerer enkeltceller i hjernen. Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks, bruk en en milliliter sprøyte til subkutant injisere bedøvet C57BL/6 mus med 100 mikrogram emulgert MOG 35-55 i 100 mikroliter av komplett Freund adjuvant i to forskjellige steder av ryggen nær nakken. På samme dag og på dag to postimmunisering injiserer intraperitoneally musene med 200 mikroliter av ett nanogram per mikroliter kikhostetoksin arbeidsløsning.Etter den andre injeksjonen, overfør musene tilbake til deres hjem bur med en oppvarming pad og overvåking til full recumbency. Neste dag og gjennom hele sykdomsforløpet, undersøk og vurder alle musene på en blindet måte for nevrologiske tegn som er skissert i bordet og for eventuelle endringer i vekt. Ved riktig eksperimentelt endepunkt, kutt kraniet forsiktig fra nesen til nakken og overfør hjernen til hvert dyr fra kranieboksen til individuelle 50 milliliter rør som inneholder 10 milliliter RPMI-medium.Bland rørene godt for å fjerne de tiltalende røde blodlegemene og fjern mediet ved aspirasjon. Tilsett 10 milliliter friskt medium til hvert rør og overfør hjernen til individuelle 100 millimeter retter. Til slutt hogge hver hjerne med en barberhøvel og bruke en plastpipette for å overføre så mye vev fra en tallerken om gangen og seks milliliter medium inn i en iskuld syv milliliter sentrert glass homogenisator.Grind hjernen ved hjelp av det løse stempelet av pestle før du bruker det stramme stempelet for å bringe vevet til suspensjonen er homogen. Hell deretter den resulterende vevsslamen i et forkjølt 15 milliliter konisk rør på is. Når alle prøvene er homogenisert, juster volumet i hvert rør til syv milliliter med friskt medium, før du legger hver vevssuspensjon til et nytt kjølt 15 milliliter rør som inneholder tre milliliter på 100% kjellermembranmatrise per rør.Bland ved inversjon et par ganger og bruk en tre milliliter pipette for å forsiktig og sakte legge til en milliliter 70 prosent tetthet gradient løsning under hver vev løsning prøve. Skill cellene etter tetthetsgradering sentrifugering og fjern nesten alle de øverste lagene, og ta vare på å fjerne all myelin helt. Overfør grensesnittet til et nytt 15 milliliter rør og juster volumet til 10 milliliter med friskt medium.Sentrifuger deretter prøvene igjen og fjern supernatanten før du gjenbruker pellets i ca 100 mikroliter medium per rør. For strømningscytokometrisk analyse av de høstede hjernecellene, alloker omtrent to ganger 10 til de seks cellene i 100 mikroliter medium til individuelle brønner av en 96-brønnsplate. Når alle cellene er belagt, tilsett 100 mikroliter med 500X cellestimuleringscocktail pluss proteintransporthemmere til brønnene og legg platen i cellekulturinkubatoren i fire timer.På slutten av inkubasjonsbassenget har cellene på bunnen av brønnene ved sentrifugering og gjenoppuspend pellets i 100 mikroliter av strømningscytometribuffer per brønn. Forhåndsinkuber cellene med tre mikroliter antimus CD16/CD32 Fc Block i 10 minutter ved fire grader Celsius før farging. For å blokkere eventuelle uspesifikke Fc-medierte interaksjoner.På slutten av inkubasjonen, legg til antistoffcocktailen av interesse for hver brønn og legg platen på fire grader Celsius beskyttet mot lys. Etter 30 minutter vasker du brønnene med 100 mikroliter av strømningscytometribuffer per brønn og sedimenter cellene ved sentrifugering. Etter å ha kastet supernativa, legg til 200 mikroliter intracellulær fikseringsbuffer til hver brønn.Etter en 30 til 60 minutters inkubasjon ved romtemperatur, samle prøvene ved sentrifugering og gjenbruk pellets i 200 mikroliter av 1X permeabilitet buffer per brønn. Sentrifuge prøvene igjen, og etter å ha kastet supernatanten, resuspend pellets i 100 mikroliter med fersk permeabiliseringbuffer. Deretter legger du til de riktige antistoffene for påvisning av intracellulære antigener av interesse for en 30 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius, beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen legger du til 100 mikroliter 1X permeabiliseringsbuffer til hver brønn og spinner ned prøvene ved sentrifugering. Deretter gjenbruker flekkcellene i 200 mikroliter av strømningscytometrifargingsbuffer og analyser cellene ved strømningscytometri i henhold til standardprotokoller. Et typisk klinisk kurs i EAE bør resultere i en sykdomskurve og endring i kroppsvekt som illustrert.C57BL/6 mus immunisert med MOG 35-55 begynner vanligvis å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10 til 12 og oppnå toppen av sykdommen rundt dag 15 til 21. Før sykdomsutbruddet øker kroppsvekten til immuniserte mus gradvis før den avtar i sammenheng med de økende sykdomssymptomene Musene viser den laveste kroppsvekten på toppen av EAE, med kroppsvekter som gjenoppretter litt etter hvert som de kliniske symptomene reduseres. Musene gjenoppretter vanligvis ikke helt, og fortsetter vanligvis å utvikle en monofasisk kronisk sykdomspatologi.Som denne representative flytanalysen illustrerer, økes interferon gammaproduserende Th1- og IL17-produserende Th17-celler betydelig i EAE-mus. Det viktigste trinnet er 3,10. Operatøren skal overføre mellomlaget og lyset, være forsiktig, ta så få andre lag som mulig.Etter denne protokollen kan vi ytterligere T-lymfocytter for videre transkripsjonsanalyse for å studere

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin oligodendrocyte Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induced Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i C57BL / 6 Mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel og effektiv produksjon og rensing av Mouse Myelin oligodendrocyte glykoprotein for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt Studier

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

En posisjonerings enhet for plassering av mus under intranasal siRNA levering til det sentrale nervesystemet

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...