Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570921 a ZJ, 81571533 para LS), Comissão Municipal de Saúde de Xangai e Planejamento Familiar (201540206 a ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 para ZJ).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê animal da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Xangai Jiao Tong.
1. Preparação dos materiais
<ol><li>Use a sequência MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35-55 para obter o peptídeo liofilizado de fontes comerciais. Certifique-se de que a pureza do peptídeo é >95%. Prepare a solução de estoque MOG de 10 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene a -20 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução d...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Este estudo apresenta um protocolo para induzir e monitorar a EAE usando MOG35-55 em camundongos C57BL/6, que são considerados um modelo animal experimental neuroimunológico típico de MS. EAE pode ser induzido variando as cepas de camundongos ou o tipo de proteína usada para indução de acordo com a finalidade do estudo. Por exemplo, o uso de peptídeos PLP139-151 em camundongos SJL pode induzir um curso de doença EAE que é especialmente adequado para avaliar efeitos terapêuticos em recaídas15<...

Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos1. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS2. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS3. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componentes de mielina, outra é a transferência adotiva transferindo células T encefalitárias para o receptor2,,4,,5. As suscetibilidades à EAE são diferentes em diferentes cepas animais6. Em camundongos C57BL/6, o desafio de mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) 35-55 induz uma doença monofásica com desmielinização extensiva e inflamação no CNS, que é frequentemente usado em experimentos com camundongos direcionados a genes7.
A geração de células T reativas específicas da mielina é necessária para a ocorrência e desenvolvimento da doença na EAE e é um sinal imunológico tanto da EAE quanto da EAE. Linfócitos T autoretivos ativados cruzam a barreira cerebral sanguínea (BBB) para a doença saudável do CNS e iniciam a doença da EAE. Quando o MOG 35-55 Ag é encontrado, esses linfócitos T induzem inflamação e o recrutamento de células effectoras para o CNS, resultando em desmielinização e destruição de axônio8,,9. No modelo EAE, há amplas evidências de que as células CD4+ T específicas do neuroantígeno podem iniciar e sustentar neuroinflamação e patologia3,,10. Dependendo das principais citocinas produzidas, os linfócitos CD4+ T foram classificados em diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado pela produção de interferon-γ), Th2 (caracterizado pela produção de interleucina 4) e Th17 (caracterizado pela produção de interleucina 17). Acredita-se que a ativação das células Th1 e Th17 contribuam para a indução, manutenção e regulação da desmielinização inflamatória na EAE e MS, secretando os efeitos IFN-γ e IL-17, capazes de ativar macrófagos e recrutar neutrófilos para os locais inflamatórios para acelerar as lesões11.
Como as células T autoativas cruzam o BBB para o CNS e induzem o desenvolvimento da doença em MS e EAE, é muito importante analisar as células T no SNC. No entanto, há muito poucos protocolos estabelecidos para o isolamento de linfócitos do CNS12. Por isso, foi desenvolvido um método otimizado para isolar células mononucleares do cérebro e analisar linfócitos T com marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para citometria de fluxo. O método utiliza o MOG35-55 adjuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxin Working Solution (PTX) para induzir um modelo ativo de imunização de EAE em camundongos. Em seguida, métodos de centrifugação de gradiente de separação mecânica e densidade são usados para o isolamento de células mononucleares CNS. Finalmente, uma estratégia otimizada de citometria de fluxo é usada para identificar linfócitos T e subconjuntos do cérebro, manchando vários marcadores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC) causada pela combinação de fatores ambientais e histórico genético suscetível. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo típico de doença de MS amplamente utilizado para investigar a patogênese na qual linfócitos T específicos para antígenos de mielina iniciam uma reação inflamatória no SNC. É muito importante avaliar como os linfócitos do SNC regulam o desenvolvimento da doença. No entanto, a abordagem para medir a quantidade e a qualidade dos linfócitos infiltrados no SNC é muito limitada devido às dificuldades em isolar e detectar linfócitos infiltrados do cérebro. Este manuscrito apresenta um protocolo para que seja útil para o isolamento, identificação e caracterização de linfócitos infiltrados do CNS e será útil para nossa compreensão de como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune CNS.

Após a imunização de camundongos C57BL/6, todos os camundongos foram pesados, examinados e classificados diariamente para sinais neurológicos. O curso clínico representativo da EAE deve resultar em uma curva da doença como apresentado na Figura 2A e uma mudança de peso corporal no camundongo como apresentado na Figura 2B. Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 geralmente começaram a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10-12 e atingir...

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

O protocolo que apresentamos aqui será útil para entendermos como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune do sistema nervoso central. Com este método, linfócitos no cérebro podem ser estudados em uma célula por célula. Este protocolo também pode ser aplicado a outros modelos e doenças do sistema nervoso central que precisavam analisar as características e funções das células imunes.Neste vídeo, o protocolo pode facilmente demonstrar como induzir modelo e isolar células únicas no cérebro. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, use uma seringa de um mililitro para injetar subcutâneamente camundongos C57BL/6 anestesiados com 100 microgramas de MOG 35-55 em 100 microlitres de completojuvante de Freund em dois locais diferentes da parte de trás perto do pescoço. No mesmo dia e no segundo dia pós-imunização, injete intraperitoneally os camundongos com 200 microliters de um nanograma por solução de trabalho de toxina de coqueluche microliter.Após a segunda injeção, transfira os ratos de volta para sua gaiola com uma almofada de aquecimento e monitoramento até a recumbência total. No dia seguinte e ao longo da doença, examine e acerde todos os camundongos de forma cega para os sinais neurológicos descritos na tabela e para quaisquer alterações de peso. No ponto final experimental apropriado, corte o crânio cuidadosamente do nariz para o pescoço e transfira o cérebro de cada animal da caixa craniana para tubos individuais de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI.Misture bem os tubos para remover os glóbulos vermelhos aderentes e remova o meio por aspiração. Adicione 10 mililitros de meio fresco a cada tubo e transfira os cérebros em pratos individuais de 100 milímetros. Finalmente corte cada cérebro com uma navalha e use uma pipeta de plástico para transferir o máximo de tecido de um prato de cada vez e seis mililitros de meio em um homogeneizador de vidro centrado em sete mililitros.Triture o cérebro usando o êmbolo solto do pilão antes de usar o êmbolo apertado para trazer o tecido até que a suspensão seja homogênea. Em seguida, despeje o chorume de tecido resultante em um tubo cônico pré-refrigerado de 15 mililitros no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido homogeneizadas, ajuste o volume em cada tubo para sete mililitros com meio fresco, antes de adicionar cada suspensão tecidual a um novo tubo refrigerado de 15 mililitros contendo três mililitros de matriz de membrana 100% por tubo.Misture por inversão algumas vezes e use uma pipeta de três mililitros para adicionar cuidadosamente e lentamente um mililitro de solução de gradiente de densidade de 70% sob cada amostra de solução de tecido. Separe as células por centrifugação gradiente de densidade e remova quase toda a camada superior, tomando o cuidado de remover completamente toda a mielina. Transfira a interface para um novo tubo de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com meio fresco.Em seguida, centrifufique as amostras novamente e remova o supernascer antes de reutilizar as pelotas em cerca de 100 microliters de médio por tubo. Para análise citométrica de fluxo das células cerebrais colhidas, aloque aproximadamente duas vezes 10 para as seis células em 100 microliters de médio em poços individuais de uma placa de 96 poços. Quando todas as células tiverem sido banhadas, adicione 100 microliters de coquetel de estimulação celular 500X mais inibidores de transporte de proteínas aos poços e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas.No final da incubação, as células na parte inferior dos poços por centrifugação e resuspensam as pelotas em 100 microliters de tampão de citometria de fluxo por poço. Pré-incubar as células com três microliters de Bloco Anti-Mouse CD16/CD32 Fc por 10 minutos a quatro graus Celsius antes de coloração. Para bloquear quaisquer interações não específicas mediadas por Fc.No final da incubação, adicione o coquetel de anticorpos de interesse a cada poço e coloque o prato a quatro graus Celsius protegido da luz. Após 30 minutos, lave os poços com 100 microliters de tampão de citometria de fluxo por poço e sedimente as células por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, adicione 200 microliters de buffer de fixação intracelular a cada poço.Após uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente, colete as amostras por centrifugação e resuspenja as pelotas em 200 microliters de 1X tampão de permeabilidade por poço. Centrifugar as amostras novamente, e depois de descartar o supernascer, resuspenque as pelotas em 100 microliters com tampão de permeabilização fresco. Em seguida, adicione os anticorpos apropriados para a detecção de quaisquer antígenos intracelulares de interesse para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidos da luz.No final da incubação, adicione 100 microlitadores de 1X tampão de permeabilização a cada poço e gire as amostras por centrifugação. Em seguida, resuspende as células de coloração em 200 microliters de tampão de coloração de citometria de fluxo e analise as células por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão. Um curso clínico típico da EAE deve resultar em uma curva da doença e mudança no peso corporal como ilustrado.Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG 35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10 a 12 e atingem o pico da doença por volta do dia 15 a 21. Antes do surgimento da doença, o peso corporal dos camundongos imunizados aumenta gradualmente antes de diminuir em correlação com os sintomas crescentes da doença Os camundongos demonstram o menor peso corporal no pico da EAE, com os pesos corporais se recuperando ligeiramente à medida que os sintomas clínicos diminuem. Os camundongos geralmente não se recuperam totalmente no entanto e normalmente passam a desenvolver uma patologia de doença crônica monofásica.Como ilustra esta análise representativa de fluxo, as células Th1 e Th17 produtoras de interferon gama são significativamente aumentadas em camundongos EAE. O passo mais importante é o 3.10. O operador deve transferir a camada média e a luz, sendo cuidadosamente, tomar o menor número possível de camadas.Seguindo estes protocolos, podemos mais linfócitos T para análise de transcrição adicional para estudar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

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Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Imunologia e Infecção

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

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Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

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