Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая гранта (31570921 к йД, 81571533 lS), Шанхай муниципальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи (201540206 до йД), Ruijin больницы Северный научно-исследовательский грант (2017'X01 до йJ).

Все описанные здесь методы были одобрены комитетом по животным Школы фундаментальных медицинских наук Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Подготовка материалов
<ol><li>Используйте последовательность MEVGWYRSPFSRHLYRNGK MOG35-55 для получения лиофилизированного пептида из коммер?...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Это исследование представляет собой протокол для индуцирования и мониторинга ЕАЕ с использованием MOG35-55 у мышей C57BL/6, которые считаются типичной нейроиммунологической экспериментальной животной моделью MS. EAE может быть индуцирована с изменением штаммов мышей или типа белка, используе...

Как хроническое демиелинизирующей болезни ЦНС, MS затрагивает около 2,5 миллионов человек во всем мире и не хватает лечебноголечения 1. Он также считается аутоиммунным заболеванием, при котором миелин антиген специфических Т-лимфоцитов инициировать воспалительные реакции и привести к демиелинизации и аксональной травмы вЦНС 2. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) широко используется для исследования патогенных механизмов MS как классическая модель аутоиммунных демиелинизации вЦНС 3. Есть два способа индуцировать ЕАЭ: один заключается в том, чтобы индуцировать EAE активно иммунизации животных с компонентами миелина, другой является приемная передача путем передачи энцефалитогенныхТ-клеток в рецептор 2,4,5. Восприимчивость к ЕАЕ различна в различных штаммах животных6. У мышей C57BL/6, миелин олигодендроцит гликопротеин (MOG) 35-55 вызов вызывает монофазное заболевание с обширной демиелинизации и воспаления в ЦНС, который часто используется в экспериментах с генно-целевыхмышей 7.
Генерация миелин-специфических реактивных Т-клеток необходима для возникновения и развития заболевания в ЕАЭ и является иммунологическим признаком как ЕАЕ, так и MS. Активированные аутореактивные Т-лимфоциты пересекают геммозефалический барьер (BBB) в здоровую ЦНС и инициируют болезнь ЕАЭ. Когда MOG 35-55 Ag встречается, эти Т-лимфоциты вызывают воспаление и набор клеток-эффекторов в ЦНС, что приводит к демиелинизации и разрушениюаксона 8,9. В модели EAE, есть достаточно доказательств того, что нейроантиген-специфические CD4И Т-клетки могут инициировать и поддерживать нейровоспламенениеи патологию 3,10. В зависимости от основных производимых цитокинов,CD4 и T лимфоциты были классифицированы на различные подмножества: Th1 (характеризуется производством интерферона-γ), Th2 (характеризуется производством интерлейкина 4) и Th17 (характеризуется производством интерлейкина 17). Считается, что активация клеток Th1 и Th17 способствует индукции, техническому обслуживанию и регуляции воспалительной демиелинизации в ЕАЭ и МС путем секреции эффекторных цитокинов IFN-γ и IL-17, которые способны активировать макрофаги и набирать нейтрофилов ввоспалительные участки для ускорения поражений 11.
Поскольку аутореактивные Т-клетки пересекают BBB в ЦНС и вызывают развитие болезни в MS и EAE, очень важно анализировать Т-клетки в ЦНС. Тем не менее, Есть очень мало установленных протоколов для изоляции лимфоцитов от ЦНС12. Поэтому был разработан метод, оптимизированный для изоляции моноядерных клеток из мозга и анализа Т-лимфоцитов с маркерами CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g и IL-17 для цитометрии потока. Метод использует MOG35-55 адъювант mycobacterium туберкулеза H37 Ra и коклюша токсина рабочего решения (PTX), чтобы вызвать активную модель иммунизации ЕАЭ у мышей. Затем для изоляции моноядерных клеток ЦНС используются методы механического разделения и центрифугации плотности. Наконец, оптимизированная стратегия цитометрии потока используется для идентификации Т-лимфоцитов и подмножества из мозга путем окрашивания нескольких маркеров.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Рассеянный склероз (МС) является аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), вызванным сочетанием факторов окружающей среды и восприимчивого генетического фона. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) является типичной моделью заболевания MS широко используется для исследования патогенеза, в котором Т-лимфоциты, характерные для миелин антигенов инициировать воспалительные реакции в ЦНС. Очень важно оценить, как лимфоциты в ЦНС регулируют развитие болезни. Тем не менее, подход к измерению количества и качества проникли лимфоцитов в ЦНС очень ограничен из-за трудностей в изоляции и обнаружения проникли лимфоцитов из мозга. Эта рукопись представляет собой протокол для того, что полезно для изоляции, идентификации и характеристики проникли лимфоцитов из ЦНС и будет полезно для нашего понимания того, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

После иммунизации мышей C57BL/6, все мыши были взвешены, рассмотрены, и градуированных ежедневно для неврологических признаков. Репрезентативный клинический курс ЕАЭ должен привести к кривой заболевания, представленной на рисунке 2A, и изменению массы тела в мыши, представ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Эта рукопись представляет собой протокол, чтобы вызвать активный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) у мышей. Метод изоляции и характеристики проникли лимфоцитов в центральной нервной системе (ЦНС) также представлен, чтобы показать, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Протокол, который мы представляем здесь, будет полезен для нас, чтобы понять, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы. С помощью этого метода, лимфоциты в головном мозге могут быть изучены изучены на клеточной основе. Этот протокол также может быть применен к другим моделям и заболевания центральной нервной системы, которые необходимы для анализа характеристик и функций иммунных клеток.В этом видео, протокол может легко продемонстрировать, как вызвать модель и изолировать одиночные клетки в головном мозге. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, использовать один миллилитр шприц подкожно вводить анестезированных C57BL/6 мышей с 100 микрограммов эмульгированных MOG 35-55 в 100 микролитров полного адъюванта Фрейнд в двух различных участках спины вблизи шеи. В тот же день и на второй день постиммунизации, интраперитонно вводить мышей с 200 микролитров одного нанограмма на микролитер коклюша токсина рабочий раствор.После второй инъекции, передать мышей обратно в свою домашнюю клетку с потеплением площадку и мониторинга до полного лежачих. На следующий день и на протяжении всего заболевания, изучить и оценка всех мышей в ослепленный образом для неврологических признаков, изложенных в таблице и для любых изменений в весе. При соответствующей экспериментальной конечной точке тщательно вырежьте череп от носа к шее и перенесите мозг каждого животного из черепной коробки в отдельные 50 миллилитровых трубок, содержащих 10 миллилитров среды RPMI.Смешайте трубки хорошо, чтобы удалить приверженец красных кровяных телец и удалить среду по аспирации. Добавьте 10 миллилитров свежей среды в каждую трубку и перенесите мозг в отдельные 100-миллиметровые блюда. Наконец нарезать каждый мозг бритвой и использовать пластиковую пипетку для передачи как можно больше ткани из одного блюда в то время, и шесть миллилитров среды в ледяной семи миллилитр по центру стекла гомогенизатора.Измельчить мозг, используя свободный поршень пестика перед использованием жесткой поршень довести ткани до подвески однородной. Затем вылейте полученную навозную ткань в предварительно охлажденную 15 миллилитровую коническую трубку на льду. Когда все образцы были гомогенизированы, отрегулируйте объем в каждой трубке до семи миллилитров со свежей средой, прежде чем добавлять каждую подвеску ткани в новую охлажденную 15 миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра 100%basement мембранной матрицы на трубку.Смешайте инверсии несколько раз и использовать три миллилитров пипетки тщательно и медленно добавить один миллилитр 70 процентов плотности градиентного раствора под каждым образцом раствора ткани. Разделит клетки по плотности градиентной центрифугации и удалите почти весь верхний слой, заботясь о том, чтобы полностью удалить весь миелин. Перенесите интерфейс в новую 15-миллилитровую трубку и отрегулируйте громкость до 10 миллилитров со свежей средой.Затем центрифуга образцов снова и удалить супернатант до повторного перерасхода гранул примерно в 100 микролитров среднего на трубку. Для цитометрического анализа потока собранных клеток мозга, выделить примерно два раза 10 на шесть клеток в 100 микролитров среды в отдельных скважин 96-хорошо пластины. Когда все клетки были поцарнуты, добавьте 100 микролитров коктейля стимуляции клеток 500X плюс ингибиторы транспортировки белка в скважины и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение четырех часов.В конце инкубационный бассейн клетки на дне скважин центрифугации и повторно гранулы в 100 микролитров потока цитометрии буфера на скважину. Предварительно инкубировать клетки с тремя микролитров Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию до окрашивания. Блокировать любые неспецифические fc-опосредованное взаимодействие.В конце инкубации добавьте к каждому хорошо коктейль из антител, представляющий интерес, и поместите пластину на четыре градуса Цельсия, защищенную от света. Через 30 минут промойте скважины 100 микролитров буфера цитометрии потока на скважину и осадочные клетки центрифугой. Отбросив супернатанты, добавьте к каждой хорошо 200 микролитров внутриклеточного буфера фиксации.После 30-60-минутной инкубации при комнатной температуре соберите образцы путем центрифугации и повторно посвоит гранулы в 200 микролитров буфера проницаемости 1X на колодец. Центрифуга образцов снова, и после отбрасывания супернатант, повторно гранулы в 100 микролитров со свежим буфером пермялизации. Далее добавьте соответствующие антитела для обнаружения любых внутриклеточных антигенов, представляющих интерес для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия, защищенных от света.В конце инкубации добавьте к каждой колодец 100 микролитров буфера проницаемой промибилизации 1X и вращайте образцы по центрифугации. Затем, повторное приостановление пятна клеток в 200 микролитров потока цитометрии окрашивания буфера и анализировать клетки по потоку цитометрии в соответствии со стандартными протоколами. Типичный клинический курс ЕАО должен привести к кривой заболевания и изменению массы тела, как показано на примере.C57BL/6 мышей, иммунизированных с MOG 35-55 обычно начинают развиваться симптомы заболевания вокруг день 10 до 12 и достичь пика заболевания около дня 15 до 21. До начала заболевания, вес тела иммунизированных мышей постепенно увеличивается, прежде чем уменьшить корреляцию с растущими симптомами заболевания Мыши демонстрируют самую низкую массу тела на пике ЕАЭ, с массой тела восстановления немного, как клинические симптомы уменьшаются. Мыши обычно не полностью восстановить однако и, как правило, перейти к разработке монофазных хронических заболеваний патологии.Как показывает этот репрезентативный анализ потока, интерферон гамма-продукции Th1 и IL17 производства Th17 клетки значительно увеличены в EAE мышей. Самый важный шаг 3.10. Оператор должен передать средний слой и свет, будучи тщательно, принять как несколько других слоев, как это возможно.Следуя этим протоколам, мы можем продолжить Т-лимфоциты для дальнейшего анализа транскрипции для изучения

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Преодоление невосприимчивости в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) штаммов мыши по усыновлению и передачи Антигенная вызов

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Миелин олигодендроцитов гликопротеин (МОГ<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Индуцированные Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) в C57BL / 6 мышей

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Позиционирующее устройство для размещения мышей во время интраназального siRNA Доставка в центральную нервную систему

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...