Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China grant (31570921 till ZJ, 81571533 till LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 till ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 till ZJ).

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av djurkommittén vid School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Beredning av materialen
<ol><li>Använd MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 för att erhålla den lyofilaterade peptiden från kommersiella källor. Se till att peptidens renhet är >95%. Bered 10 mg/mL MOG-stamlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara vid -20 °C.</li>
	<li>Bered en 4 mg/mL stamlösning av M. tuberkulos H37 ...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Denna studie presenterar ett protokoll för att inducera och övervaka EAE med hjälp av MOG35-55 i C57BL/6 möss, som anses vara en typisk neuroimmunological experimentella djur modell av MS. EAE kan induceras varierande möss stammar eller vilken typ av protein som används för induktion enligt syftet med studien. Till exempel, med hjälp av PLP139–151 peptid i SJL möss kan framkalla en skovledslöpande EAE sjukdomsförloppet som är särskilt väl lämpad för att bedöma terapeutiska effekter på skov<sup class="...

Som en kronisk demyelinating sjukdom i CNS, MS drabbar cirka 2,5 miljoner människor över hela världen och saknar botande behandlingar1. Det anses också vara en autoimmun sjukdom, där myelin antigen specifika T-lymfocyter initiera en inflammatorisk reaktion och leda till demyelination och axonal skada i CNS2. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i stor utsträckning för att undersöka patogena mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelination sjukdom modell i CNS3. Det finns två sätt att inducera EAE: ett är att inducera EAE aktivt genom att immunisera djur med myelinkomponenter, en annan är adoptivöverföring genom att överföra encefalitogena T-celler till receptor2,4,5. Mottagligheterna för EAE är olika i olika djurstammar6. Hos C57BL/6-möss inducerar myelinoligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35–55-utmaning en monofasisk sjukdom med omfattande demyelination och inflammation i CNS, som ofta används i försök med geninriktade möss7.
Genereringen av myelinspecifika reaktiva T-celler krävs för förekomst och utveckling av sjukdom i EAE och är ett immunologiskt tecken på både EAE och MS. Aktiverade autoreaktiva T-lymfocyter korsar blodhjärnbarriären (BBB) i den friska CNS och initierar EAE-sjukdomen. När MOG 35–55 Ag påträffas framkallar dessa T-lymfocyter inflammation och rekrytering av effektorceller till CNS, vilket resulterar i demyelination och axonförstörelse8,9. I EAE-modellen finns det gott om bevis för att neuroantigenspecifika CD4+ T-celler kan initiera och upprätthålla neuroinflammation och patologi3,10. Beroende på de stora cytokiner som produceras, CD4+ T-lymfocyter har klassificerats i olika delmängder: Th1 (kännetecknas av produktion av interferon-γ), Th2 (kännetecknas av produktion av interleukin 4), och Th17 (kännetecknas av produktion av interleukin 17). Man tror att aktivering av Th1 och Th17 celler bidrar till induktion, underhåll, och reglering av inflammatorisk demyelination i EAE och MS genom att utsöndra effektor cytokiner IFN-γ och IL-17, som är i stånd att aktivera makrofager och rekrytera neutrofiler till de inflammatoriska platserna för att påskynda de skador11.
Eftersom autoreaktiva T-celler korsar BBB i CNS och inducerar utvecklingen av sjukdom i MS och EAE, är det mycket viktigt att analysera T-celler i CNS. Det finns dock mycket få etablerade protokoll för isolering av lymfocyter från CNS12. Därför utvecklades en metod som är optimerad för att isolera mononukleära celler från hjärnan och analysera T-lymfocyter med markörerna CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g och IL-17 för flödescytometri. Metoden använder MOG35– 55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra och Pertussis Toxin Working Solution (PTX) för att inducera en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos möss. Därefter används mekaniska separations- och densitetsgradientcentrifugationsmetoder för isolering av CNS mononukleära celler. Slutligen används en optimerad flödescytometri gating strategi för att identifiera T-lymfocyter och delmängder från hjärnan genom färgning av flera markörer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multipel skleros (MS) är en autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som orsakas av kombinationen av miljöfaktorer och mottaglig genetisk bakgrund. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en typisk sjukdom modell av MS används allmänt för att undersöka patogenesen i vilka T-lymfocyter specifika för myelin antigener initiera en inflammatorisk reaktion i CNS. Det är mycket viktigt att bedöma hur lymfocyter i CNS reglerar utvecklingen av sjukdom. Men tillvägagångssättet för att mäta kvantitet och kvalitet av infiltrerade lymfocyter i CNS är mycket begränsad på grund av svårigheterna att isolera och upptäcka infiltrerade lymfocyter från hjärnan. Detta manuskript presenterar ett protokoll för som är användbart för isolering, identifiering och karakterisering av infiltrerade lymfocyter från CNS och kommer att vara till hjälp för vår förståelse av hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.

Efter immunisering av C57BL/6 möss, var alla möss vägas, undersökts och graderas dagligen för neurologiska tecken. Den representativa kliniska kursen för EAE bör resultera i en sjukdomskurva som presenteras i figur 2A och en förändring av kroppsvikten i musen som presenteras i figur 2B. C57BL/6-möss som immuniserats med MOG35-55 började vanligtvis utveckla sjukdomssymptom runt dag 10–12 och uppnådde toppen av sjukdom omkring dag 15–21 efter aktiv...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Det protokoll vi presenterar här kommer att vara till hjälp för oss att förstå hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av det centrala nervsystemet autoimmun sjukdom. Med denna metod kan lymfocyter i hjärnan studeras studeras på en cell för cell basis. Detta protokoll kan också tillämpas på andra modeller och centrala nervsystemet sjukdom som behövs för att analysera egenskaper och funktioner hos immunceller.I den här videon kan protokollet enkelt visa hur man inducerar modell och isolerar enstaka celler i hjärnan. Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedal reflex, använd en en milliliter spruta för att subkutant injicera sövda C57BL/6 möss med 100 mikrogram emulgerade MOG 35-55 i 100 mikroliter av komplett Freunds adjuvant i två olika platser i ryggen nära halsen. Samma dag och dag två postimmunisering injicerar intraperitoneally mössen med 200 mikroliter av ett nanogram per mikroliter per pertussis toxin arbetslösning.Efter den andra injektionen, överför mössen tillbaka till deras hem bur med en uppvärmning pad och övervakning tills full recumbency. Nästa dag och under hela sjukdomsredningen, undersöka och gradera alla möss på ett förblindat sätt för de neurologiska tecken som beskrivs i tabellen och för eventuella förändringar i vikt. Vid lämplig experimentell endpoint skär man kraniet försiktigt från näsan till halsen och överför hjärnan hos varje djur från kraniallådan till individuella 50 milliliterrör som innehåller 10 milliliter RPMI-medium.Blanda rören väl för att ta bort de vidhäftande röda blodkropparna och ta bort mediet genom aspiration. Tillsätt 10 milliliter färskt medium till varje rör och överföra hjärnorna till enskilda 100 millimeters rätter. Slutligen hugga varje hjärna med en rakhyvel och använda en plastpipett för att överföra så mycket vävnad från en maträtt i taget och sex milliliter medium till en iskallt sju milliliter centrerad glas homogenisator.Mala hjärnan med hjälp av den lösa kolven i mortelstöten innan du använder den snäva kolven för att få vävnaden tills suspensionen är homogen. Häll sedan den resulterande vävnadsslamman i en förkyld 15 milliliter konisk röret på is. När alla proverna har homogeniserats, justera volymen i varje rör till sju milliliter med färskt medium, innan du lägger varje vävnad suspension till en ny kyld 15 milliliter rör som innehåller tre milliliter av 100%källaren membranmatris per rör.Blanda genom inversion några gånger och använd en tre milliliter pipetter för att noggrant och långsamt lägga till en milliliter av 70 procent densitet gradient lösning under varje vävnad lösning prov. Separera cellerna genom densitet gradient centrifugation och ta bort nästan alla av det översta lagret, var noga med att helt ta bort alla myelin. Överför gränssnittet till ett nytt 15 milliliterrör och justera volymen till 10 milliliter med färskt medium.Sedan centrifugerna proverna igen och ta bort supernatanten innan de återsänder pelletsen i cirka 100 mikroliter medium per rör. För flödescytometrisk analys av de skördade hjärncellerna, fördela ungefär två gånger 10 till de sex cellerna i 100 mikroliter av medium i enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta. När alla celler har pläterats, tillsätt 100 mikroliter av 500X cell stimulering cocktail plus proteintransport hämmare till brunnarna och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i fyra timmar.I slutet av inkubationen poolen cellerna i botten av brunnarna genom centrifugering och resuspend pellets i 100 mikroliter av flödescytometri buffert per brunn. Förinkubera cellerna med tre mikroliter av Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block i 10 minuter vid fyra grader Celsius före färgning. Att blockera alla ospecifika Fc-medierade interaktioner.I slutet av inkubationen, tillsätt antikroppscocktail av intresse till varje brunn och placera plattan vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. Efter 30 minuter, tvätta brunnarna med 100 mikroliter av flödescytometribuffert per brunn och sediment cellerna genom centrifugering. Efter att du har kastat supernatanterna, tillsätt 200 mikroliter av intracellulär fixeringsbuffert till varje brunn.Efter en inkubering på 30 till 60 minuter vid rumstemperatur, samla in proverna genom centrifugering och återanvända pelletsen i 200 mikroliter av 1X permeabilitetsbuffert per brunn. Centrifugera proverna igen, och efter att ha kasserat supernatanten, resuspend pellets i 100 mikroliter med färsk permeabilisering buffert. Därefter lägger till lämpliga antikroppar för detektion av eventuella intracellulära antigener av intresse för en 30 minuters inkubation vid fyra grader Celsius, skyddad från ljus.I slutet av inkubationen, tillsätt 100 mikroliter av 1X permeabiliseringsbuffert till varje brunn och snurra ner proverna genom centrifugation. Sedan, resuspend fläcken celler i 200 mikroliter av flödescytometri färgning buffert och analysera cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll. En typisk klinisk kurs av EAE bör resultera i en sjukdom kurva och förändring i kroppsvikt som illustreras.C57BL/6 möss immuniserade med MOG 35-55 brukar börja utveckla sjukdomssymtom runt dag 10 till 12 och uppnå toppen av sjukdom runt dag 15 till 21. Före sjukdomsuppgången ökar kroppsvikten hos immuniserade möss gradvis innan de minskar i samband med de ökande sjukdomssymtomen Mössen visar den lägsta kroppsvikten på toppen av EAE, med kroppsvikter som återhämtar sig något när de kliniska symtomen minskar. Mössen brukar inte återhämta sig helt dock och brukar vanligtvis fortsätta att utveckla en monofasisk kronisk sjukdom patologi.Som denna representativa flödesanalys illustrerar, är interferon gammaproducerande Th1- och IL17-producerande Th17-celler signifikant ökade hos EAE-möss. Det viktigaste steget är 3.10. Operatören bör överföra mellanlager och ljuset, är noga, ta så få andra lager som möjligt.Efter dessa protokoll kan vi ytterligare T-lymfocyter för ytterligare transkriptionsanalys för att studera

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducerad Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) hos C57BL / 6 möss

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

En positioneringsenhet för placering av möss under intranasal siRNA leverans till centralanervsystemet

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...