Name: flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2020-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibe (31570921 ZJ, 81571533 LS), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu ve Aile Planlaması (201540206 ZJ), Ruijin Hastanesi Kuzey araştırma hibe (2017ZX01 ZJ) tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Temel Tıp Bilimleri Okulu, Şangay Jiao Tong Üniversitesi hayvan komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Ticari kaynaklardan liyofilize peptid elde etmek için MOG35-55'in MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK dizisini kullanın. Peptitin saflığının %gt;%95 olduğundan emin olun. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 10 mg/mL MOG stok çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>M. tüberküloz H37 Ra'nın 4...

<ol>
	<li>Milo, R., Kahana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+geoepidemiology,+genetics+and+the+environment.">Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment.</a> Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).</li><li>Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+pathogenesis+and+therapy+of+multiple+sclerosis+via+animal+models:+70+years+of+merits+and+culprits+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+research.">Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research.</a> Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).</li><li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals.">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li><li>Lassmann, H., Wisniewski, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+relapsing+experimental+allergic+encephalomyelitis:+clinicopathological+comparison+with+multiple+sclerosis.">Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis.</a> Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).</li><li>Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+necessity+in+the+pathogenesis+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice.">T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).</li><li>Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+(EAE)+in+mice.+I.+Induction+of+EAE+with+mouse+spinal+cord+homogenate+and+myelin+basic+protein.">Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein.</a> Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Bramow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+versus+remyelination+in+progressive+multiple+sclerosis.">Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis.</a> Brain. 133, 2983-2998 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+multiple+sclerosis.">Immunology of multiple sclerosis.</a> Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).</li><li>McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells,+gammadelta+T+cells+and+their+interplay+in+EAE+and+multiple+sclerosis.">Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis.</a> Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiamine+deficiency+promotes+T+cell+infiltration+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+the+involvement+of+CCL2.">Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2.</a> Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).</li><li>Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Isolation+from+Brain,+Spinal+Cord,+and+Meninges+for+Flow+Cytometric+Analysis.">Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis.</a> Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).</li><li>Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+EAE+through+IL-6+and+MCP-1-mediated+T+cells+infiltration.">Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).</li><li>Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+a+myelin+basic+protein+peptide+analog+alters+the+cellular+composition+of+leukocytes+infiltrating+the+cerebrospinal+fluid.">Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid.</a> Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).</li><li>Tietz, S. M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Impairment+of+the+Endothelial+and+Glial+Barriers+of+the+Neurovascular+Unit+during+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+In+Vivo.">Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).</li></ol>

Bu çalışma, MS. EAE'nin tipik bir nöroimmünolojik deneysel hayvan modeli olarak kabul edilen C57BL/6 farelerinde MOG35-55 kullanarak EAE'yi indüklemek ve izlemek için bir protokol sunmaktadır. Örneğin, SJL farelerde PLP139-151 peptid kullanarak özelliklerelaps15terapötik etkileri değerlendirmek için uygun bir nüks-remitting EAE hastalığı ders neden olabilir. Burada özetlenen deneysel prosedür diğer EAE protokollerine de uygulanabilir7. Bu modelde C57BL/...

CNS kronik bir demiyelinating hastalık olarak, MS dünya çapında yaklaşık 2,5 milyon kişi etkiler ve küratif tedavileryoksun 1. Ayrıca bir otoimmün hastalık olarak kabul edilir, hangi miyelin antijen spesifik T lenfositler inflamatuar bir reaksiyon başlatmak ve CNS demiyelinasyon ve aksonal yaralanmaya yol2. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) yaygın CNS bir klasik otoimmün demiyelinasyon hastalığı modeli olarak MS patojenik mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır3. EAE ikna etmek için iki yolu vardır: bir miyelin bileşenleri ile hayvanlar aşılayarak aktif EAE ikna etmektir, başka reseptöriçineensefalojenik T hücreleri aktararak benimseyen transfer 2,4,5. EAE duyarlılıkları farklı hayvan suşları farklıdır6. C57BL/6 farelerinde, myelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) 35-55 sorun cns geniş demiyelinasyon ve inflamasyon ile monophasik bir hastalığa neden olur, sık sık gen hedefli fareler ile deneylerde kullanılan7.
EAE'de hastalığın oluşumu ve gelişimi için miyelinspesifik reaktif T hücrelerinin üretimi gereklidir ve hem EAE hem de MS. Aktif otoreaktif T lenfositlerinin sağlıklı CNS'ye kan beyin bariyerini (BBB) geçmelerinin ve EAE hastalığının başlatılmasının immünolojik bir işaretidir. MOG 35-55 Ag karşılaştığında, Bu T lenfositler inflamasyon ve CNS içine efektör hücrelerin işe neden, demiyelinasyon ve akson yıkımı ile sonuçlanan8,9. EAE modelinde, nöroantijene özgü CD4+ T hücrelerinin nöroinflamasyon vepatolojiyibaşlatabildiği ve sürdürebileceğine dair yeterli kanıt vardır 3,10. Üretilen majör sitokinlere bağlı olarak, CD4+ T lenfositler farklı alt kümelere sınıflandırılmıştır: Th1 (interferon-γ üretimi ile karakterize), Th2 (interlökin üretimi ile karakterize 4), ve Th17 (interlökin üretimi ile karakterize 17). Bu Th1 ve Th17 hücrelerinin aktivasyonu indüksiyon katkıda olduğuna inanılmaktadır, bakım, ve EAE ve MS inflamatuar demiyelinasyon düzenlenmesi etki edici sitokinler IFN-γ ve IL-17 salgılayarak, hangi makrofajlar aktive yeteneğine sahip ve lezyonları hızlandırmak için inflamatuar sitelere nötrofiller işe11.
Otoreaktif T hücreleri BBB'yi CNS'ye geçtiği nden ve MS ve EAE'de hastalığın gelişmesine neden olduğundan, CNS'deki T hücrelerini analiz etmek çok önemlidir. Ancak, CNS12lenfositlerin izolasyonu için çok az kurulmuş protokoller vardır. Bu nedenle, beyinden mononükleer hücreleri izole etmek ve t lenfositleri cd45, CD11b, CD3, CD4, INF-g ve IL-17 ile analiz etmek için optimize edilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Yöntem farelerde EAE aktif bir bağışıklama modeli neden MOG35-55 adjuvan Mycobacterium tuberculosis H37 Ra ve Pertussis Toksin Çalışma Solüsyonu (PTX) kullanır. Daha sonra CNS mononükleer hücrelerin izolasyonu için mekanik ayırma ve yoğunluk gradyan santrifüj yöntemleri kullanılır. Son olarak, bir optimize akış sitometri gating stratejisi birden fazla belirteçleri boyama tarafından beyinden T lenfositler ve alt kümeleri tanımlamak için kullanılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-0454-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFN-g</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>353107542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4975-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Intracellular Fixation &#38; Permeabilization Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Adjuvant Complete (CFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>56-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse IL-17A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7177-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-2980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4301-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MOG35&#8211;55 peptides</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td></td>
			<td>MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of lymphocyte infiltration in central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis

Multipl skleroz (MS), çevresel faktörler ve duyarlı genetik arka planın birleşimi ile oluşan merkezi sinir sisteminin (CNS) otoimmün bir hastalığıdır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), Miyelin antijenlerine özgü T lenfositlerinin CNS'de inflamatuar reaksiyon başlattığı patogenezi araştırmak için yaygın olarak kullanılan tipik bir MS hastalığı modelidir. CNS lenfositler hastalığın gelişimini nasıl düzenleyen değerlendirmek için çok önemlidir. Ancak, CNS'de infiltrasyonlu lenfositlerin miktarını ve kalitesini ölçme yaklaşımı, beyinden sızmış lenfositlerin izole edilmesi ve saptanmasındaki güçlükler nedeniyle çok sınırlıdır. Bu el yazması, CNS'den infiltrasyona geçen lenfositlerin izolasyonu, tanımlanması ve karakterizasyonu için yararlı olan bir protokol sunar ve lenfositlerin CNS otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır.

C57BL/6 farelerinin bağışıklaştırılmasından sonra tüm fareler nörolojik bulgular için tartıldı, incelendi ve günlük olarak derecelendi. EAE'nin temsili klinik seyri Şekil 2A'da sunulduğu gibi bir hastalık eğrisi ve Şekil 2B'desunulduğu gibi farede vücut ağırlığının değişmesiile sonuçlanmalıdır. MOG35-55 ile aşılanmış C57BL/6 fareler genellikle 10-12.Figure 2A Ağırlık değişimi EAE modelinde d...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Burada sunduğumuz protokol, lenfositlerin merkezi sinir sistemi otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntemle beyindeki lenfositler hücre bazında çalışılabilir. Bu protokol aynı zamanda bağışıklık hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonlarını analiz etmek için gerekli diğer modeller ve merkezi sinir sistemi hastalığı uygulanabilir.Bu videoda, protokol kolayca model neden ve beyinde tek hücreleri izole nasıl gösterebilir. Pedal refleksyanıt eksikliği doğruladıktan sonra, subkutan döşeli C57BL/6 fareler emülsifiye MOG 35-55 100 mikrogram ile enjekte etmek için bir mililitreşli şırınga kullanın tam Freund's adjuvan boynuna yakın iki farklı sitelere 100 mikrolitre. Aynı gün ve ikinci gün postimmunizasyon, intraperitoneally mikrolitre pertussis toksin çalışma çözeltisi başına bir nanogram 200 mikrolitre ile fareler enjekte.İkinci enjeksiyondan sonra, fareleri bir ısınma yastığı ile ev kafesine geri aktarın ve tam işe kadar izleyin. Ertesi gün ve hastalığın seyri boyunca, tabloda özetlenen nörolojik işaretler ve kilo herhangi bir değişiklik için kör bir şekilde tüm farelerincelemek ve derece. Uygun deneysel bitiş noktasında, kafatasını burundan boyuna dikkatlice kesin ve her bir hayvanın beynini kafatası kutusundan 10 mililitre RPMI ortamı içeren 50 mililitrelik tüplere aktarın.Yapışık kırmızı kan hücrelerini kaldırmak ve aspirasyon ile orta kaldırmak için tüpleri iyice karıştırın. Her tüp e 10 mililitre taze ortam ekleyin ve beyinleri 100 milimetrelik ayrı ayrı yemeklere aktarın. Son olarak bir jilet ile her beyin doğrayın ve bir seferde bir çanak kadar doku ve orta altı mililitre bir buzsoğuk yedi mililitre merkezli cam homogenizer içine aktarmak için plastik bir pipet kullanın.Süspansiyon homojen olana kadar doku getirmek için sıkı piston kullanmadan önce havanesiz gevşek piston kullanarak beyin grind. Daha sonra, buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitrekonik tüp içine elde edilen doku bulamaç dökün. Tüm numuneler homojenize edildiğinde, her tüpteki hacmi taze orta ile yedi mililitreye ayarlayın, her doku süspansiyonu tüp başına %100 bazal membran matrisinüç mililitre içeren yeni bir soğutulmuş 15 mililitrelik tüpe eklemeden önce.Birkaç kez ters tarafından karıştırın ve dikkatle ve yavaş yavaş her doku çözeltisi örnek altında yüzde 70 yoğunluk gradyan çözeltibir mililitre eklemek için üç mililitrelik pipet kullanın. Yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın ve üst tabakanın hemen hemen tüm kaldırmak, tamamen tüm miyelin kaldırmak için özen. Arayüzü yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hacmi taze orta ile 10 mililitreye ayarlayın.Daha sonra numuneleri tekrar santrifüj edin ve tüp başına yaklaşık 100 mikrolitre orta peletleri yeniden sumadan önce süpernatantı çıkarın. Hasat edilen beyin hücrelerinin akış sitometrik analizi için, 100 mikrolitre ortadaki altı hücreye yaklaşık iki kez 10 ayırın. Tüm hücreler kaplandığında, kuyulara 100 mikrolitre 500X hücre stimülasyon kokteyli artı protein taşıma inhibitörleri ekleyin ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Kuluçka havuzunun sonunda kuyuların altındaki hücreler santrifüj ile ve kuyu başına 100 mikrolitre akış sitometri tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block'un üç mikrolitresi ile hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Fc aracılı olmayan herhangi bir etkileşimi engellemek için.Kuluçka sonunda, her kuyuya ilgi antikor kokteyli ekleyin ve plakayı ışıktan korunan dört dereceye yerleştirin. 30 dakika sonra kuyuları kuyu başına 100 mikrolitre akış sitometri tamponu ile yıkayın ve hücreleri santrifüj ile tortulayın. Supernatants attıktan sonra, her kuyuya 200 mikrolitre hücre içi fiksasyon tamponu ekleyin.Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, numuneleri santrifüj le toplayın ve kuyu başına 1X geçirgenlik tamponunun 200 mikrolitresinde peletleri yeniden askıya alın. Numuneleri tekrar santrifüj edin ve süpernatantı attıktan sonra, taze permeabilizasyon tamponu ile 100 mikrolitrede peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, ışıktan korunan 4 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için herhangi bir hücre içi antijenin inkübasını tespit etmek için uygun antikorları ekleyin.Kuluçka sonunda, her kuyuya 100 mikrolitre 1X permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri santrifüj le aşağı çevirin. Daha sonra, akış sitometri boyama tampon 200 mikrolitre leke hücreleri resuspend ve standart protokollere göre akış sitometri ile hücreleri analiz. EAE tipik bir klinik ders bir hastalık eğrisi ve vücut ağırlığında değişiklik gibi gösterildiği gibi neden olmalıdır.MOG 35-55 ile aşılanmış C57BL/6 fareler genellikle 10-12 gün civarında hastalık belirtileri geliştirmeye başlar ve 15-21 gün civarında hastalığın doruk noktasına ulaşmak. Hastalığın başlangıcından önce, bağışıklık farelerin vücut ağırlığı giderek artan hastalık belirtileri ile korelasyon azalan önce artar Fareler EAE zirvesinde en düşük vücut ağırlığı göstermek, klinik belirtiler azaldıkça vücut ağırlıkları biraz iyileşme ile. Fareler genellikle tam olarak ancak kurtarmak ve genellikle monophasic kronik hastalık patolojisi geliştirmek için devam yok.Bu temsili akış analizinin de gösterdiği gibi, EAE farelerde interferon gama üreten Th1 ve IL17 üreten Th17 hücreleri önemli ölçüde artmaktadır. En önemli adım 3.10. Operatör orta tabaka ve ışık transferi gerekir, dikkatli olmak, mümkün olduğunca az diğer katmanları olarak almak.Bu protokolü takiben, daha fazla transkripsiyon analizi için daha fazla T lenfositler çalışma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 Farelerde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Bağlı

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Merkezi Sinir Sistemine İntranazal siRNA Teslimi Sırasında Farelerin Yerleştirilmesi için Bir Konumlandırma Cihazı

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...