Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

ونحن ممتنون جدا للدكتورة بريجيت شتورم لدعمها مع صك ECLIA.

تم الحصول على الموافقة على شراء خزعة الجلد لأغراض البحث من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى الأطفال في ويستميد، أستراليا. تم الحصول على الموافقة على التجارب على الحيوانات من الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والبحوث والاقتصاد، والتي أجريت وفقا للوائح المحلية لرعاية الحيوان (GZ: 66....

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

لقياس MeCP2 الذاتية، المؤتلف ة MeCP2 وTAT-MeCP2 المستويات، تم تطوير لوحة 96 بئر ECLIA. وقد ثبت أن فقدان وظيفة البروتين MeCP2 يؤدي إلى متلازمة RTT6, العلاج الذي يقتصر حاليا على إدارة الأعراض والعلاج الطبيعي. أحد طرق العلاج الواعدة هو ما يسمى العلاج ببدائل البروتين ، حيث يمكن أن يتم تأنيب مستويات...

ويستند المناعة الكهربية (ECLIA) على عملية تستخدم التسميات المصممة لانبعاث الإنارة عندما يحفز كيميائيا. وهي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع للكشف الكمي عن الأدوية البيولوجية في الصناعة الأساسية والبحوث الأكاديمية وصناعة الأغذية وكذلك في التشخيص السريري1. عادة، يتم استخدام لوحة 96-جيدا يمكن التخلص منها مع أقطاب الحبر الكربون. تعمل هذه الأقطاب الكهربائية كناقل للمرحلة الصلبة للمناعة. يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى تسمية electrochemiluminescent وعندما يتم تطبيق الكهرباء على النظام ، يتم تشغيل الانبعاثات الخفيفة للتسمية الكيميائية. جهاز عالي الضوضاء جداً (CCD) يسجل شدة الضوء التي تتناسب مباشرة مع المستضد المرتبط بالجسم المضاد لالتقاط مما أدى إلى التحديد الكمي للحازة المستهدفة للعينة2. بالمقارنة مع الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، تعتبر ECLIA مفيدة لأنها توفر حساسية وقابلية تكرار أعلى بالإضافة إلى أتمتة واتساق أفضل3.
هنا قمنا بتحليل البروتين الملزم الميثيل-CpG 2 (MeCP2) مستويات في عينات من أصل الإنسان والمورين، فضلا عن المتغيرات المختلفة من البروتين المؤتلف باستخدام نظام ECLIA وضعت حديثا. MecP2 هو بروتين حمض يجليد الحمض النووي المرتبط بـ X والمعروف بالتفاعل مع تسلسل الحمض النووي الميثيلي. وقد تورط هذا البروتين في تنظيم التعبير الجيني4,5. فقدان وظيفة الطفرات في الجين الذي ترميز هذا البروتين هي الجناة الرئيسيين المسببة لمتلازمة Rett (RTT), اضطراب النمو العصبي الشديد6. اضطراب آخر متعلق بMeCP2 ، متلازمة الازدواجية MECP2 ، يؤدي أيضًا إلى أعراض عصبية يمكن أن تتداخل مع أعراض RTT7. وتجدر الإشارة إلى أن الإناث يتأثرن في الغالب بـ RTT في حين أن الذكور يعانون في الغالب من متلازمة الازدواجية MECP2 6,7.
وترتبط هذه الاضطرابات مع مستويات MeCP2 غير كافية أو زائدة على التوالي في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وبالتالي، فإن خيارات العلاج لRTT التي تنطوي على زيادة مستويات MeCP2 في الجهاز الوطني للدراسات الفضائية تحتاج إلى تجنب الآثار الضارة المرتبطة بفائض MeCP27. ونتيجة لهذه الحقيقة، فإن التحديد الكمي الشديد الحساسية والدقيق لمستويات البروتين MeCP2، كما يوفره نظام ECLIA، أمر بالغ الأهمية للنهوض بRTT وكذلك أبحاث متلازمة الازدواجية MECP2. القياسات الدقيقة لمستويات MeCP2 الذاتية والخارجية من خطوط الخلايا البشرية وعينات أنسجة الماوس وكذلك البروتين المؤتلف الذي يتكون من الإنسان MeCP2 isoform B (المعروف أيضا باسم isoform e1) ، والحد الأدنى N-المحطة HIV-TAT نقل المجال (TAT-MeCP2) التي لديها القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ8,9 وترد في هذا العمل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

وECLIA هو طريقة متعددة الاستخدامات التي هي قادرة على تحديد كميات البروتين الذاتية والمؤتلفة في شكل 96 بئر. لإثبات كفاءة ECLIA، تم استخدام هذا القول لتحليل المستويات الجوهرية من MeCP2 في أنسجة الدماغ الماوس والاستيلاء على TAT-MeCP2 في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. تنتج MeCP2-ECLIA قياسات دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس. باختصار، قمنا بتطوير طريقة كمية لتقييم متغيرات البروتين MeCP2 التي يمكن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية.

ويرد وصف لمبدأ نظام ECLIA في الشكل 1. يتم عرض المنحنيات القياسية لاثنين من متغيرات MeCP2 في الشكل 2. وكان من الممكن التحديد الكمي الدقيق على مدى مجموعة واسعة من التركيزات (1-800 1 نانوغرام/مل). في الشكل 3، تم تحليل مستويات MeCP2 من تحللات مشتقة من دماغ الم...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

المناعة الكهربية chemiluminescence (ECLIA) هو نهج جديد للكشف الكمي من المتغيرات البروتين MeCP2 المحلية وتطبيقها خارجيًا ، والتي تنتج قياسات كمية ودقيقة وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس على نطاق عمل واسع. هنا، يتم وصف بروتوكول MeCP2-ECLIA في شكل 96-well.

والكهربائية القائمة على القول بالبروتين MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

وECLIA هو طريقة بسيطة لكنها فعالة لتحديد مستويات الخلوية MeCP2. إن ECLIA سريع، وأكثر حساسية، وأسهل في التعامل معه مقارنة بطرق القياس الكمي الأخرى مثل البقعة الغربية و ELISA. لإعداد محلول الغسيل، وهو 0.5٪ Tween 20 في برنامج تلفزيوني، إضافة 500 ميكرولتر من توين 20 لتر واحد من برنامج تلفزيوني ومزيج بقوة.إعداد حل حجب 3٪ مانع A وBBS ويحرك بلطف. تعقيم حل الحجب عن طريق الترشيح. لإعداد محلول diluent المقايسة ، 1 ٪ مانع A ، وبرنامج تلفزيوني ، إضافة خمسة ملليلتر من محلول حظر إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.بعد ذلك ذوبان الماوس أحادي النسيلة المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد. مزيج 0.67 ميكرولترات من الأجسام المضادة مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم دوامة الحل. لمعطف حل لوحة ربط عالية 96-جيدا، الاستغناء بعناية 25 ميكرولترات من حل الطلاء في الزاوية السفلية من كل بئر، وذلك باستخدام أنبوبة متعددة القنوات.داب لوحة 96-جيدا بلطف على كل جانب لضمان أن الحل طلاء يغطي الجزء السفلي من كل بئر. ختم لوحة مع احباط لاصقة، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. استرداد لوحة 96-جيدا من الثلاجة وإزالة احباط.إزالة محلول طلاء الأجسام المضادة في الآبار عن طريق النقر عليه في حاوية النفايات. ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية. المقبل، إضافة 125 ميكرولترات من حل حجب لكل بئر.ثم ختم لوحة مرة أخرى مع احباط لاصقة. ضع اللوحة على متن لوحة صغيرة مدارية، تم ضبطها عند 800 دورة في الدقيقة، وحضنها لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ذوبان على الجليد قارورة واحدة من MeCP2 أو تات MeCP2 محلول مخزون البروتين، lysates الدماغ الماوس، وslysates HDF.تخفيف محلول مخزون البروتين في أنابيب نظيفة كما هو موضح في الجدول الثاني من المخطوطة. التالي يخفف عينات ال ليسات. بالنسبة لـ lysates الدماغ الماوس، استخدم 1 إلى 20 ميكروغرام لكل 25 ميكرولترات من العازلة تحلل.بالنسبة لـ HDF، أضف 0.25 إلى ميكروغرام واحد لكل 25 ميكرولترات من عازلة التحلل. بعد أن تم احتضان لوحة 96-well لمدة 90 دقيقة، وإزالة حل حجب من الآبار عن طريق الخفقان في حاوية النفايات. ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية.ثم غسل لوحة ثلاث مرات مع 150 ميكرولترات من محلول الغسيل، عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور. إضافة 25 ميكرولترات من المعايير والعينات إلى آبار لوحة 96 جيدا. ختم لوحة واحتضانه لمدة أربع ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة مع ثابت 800 دورة في الدقيقة تهتز.ذوبان الأجسام المضادة الكشف غير المُسمَّاة، الأرانب المضادة لـ MeCP2، على الجليد. باستخدام محلول مُلَيّم المقايسة، يُخفف الجسم المضاد بنسبة 1 إلى 6000. عندما يتم الانتهاء من لوحة 96-well احتضان على شاكر، وإزالة المعايير والعينات عن طريق نفض الغبار لوحة في حاوية النفايات.ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية. اغسل الطبق ثلاث مرات مع 150 ميكرولترات من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور. إضافة 25 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة كشف غير المسمى إلى كل بئر مع أنبوبة متعددة القنوات.ختم لوحة واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة. الحصول على الأجسام المضادة الثانوية محددة من الثلاجة ووضعها ثلج واحد. تخفيف الجسم الثانوي في محلول diluent المقايسة ومزيج بلطف.لإزالة الأجسام المضادة للكشف غير المُسمَّاة من لوحة 96-well، حرك في حاوية النفايات ثم انقر فوق اللوحة على منشفة ورقية. بعد غسل لوحة ثلاث مرات كما هو موضح بحسد، إضافة 25 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر مع ألواح الأنابيب متعددة القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحرة عن طريق الخفقان في حاوية النفايات والتنصت على لوحة على منشفة ورقية ثم غسل لوحة ثلاث مرات، كما هو موضح سابقا. إلى كل بئر من لوحة، إضافة 150 ميكرولترات من 1X تريس قاعدة الذهب قراءة العازلة مع السطح، التي تحتوي على ثلاثيروبيلامين باعتباره coreactant لتوليد الضوء. لتجنب إنتاج فقاعات الهواء، استخدم تقنيات الأنابيب العكسية.ضع لوحة 96-well على منصة microplate مع نظام الكشف عن الكيمياء الكهربائية. باستخدام المدمج في كاميرا CCD، تبدأ على الفور التقاط البيانات. عدد إشارات التسجيل التي تتوافق مع وحدات الضوء النسبية وتناسب بشكل مباشر مع شدة الضوء.تم إنشاء منحنيات MeCP2 القياسية من MeCP2 الإنسان في قياسات متعددة. يمكن لـ ECLIA تحديد مقدار MeCP2 البشري المؤتلف بدقة على مدى نطاق يتراوح بين نانوغرام واحد لكل ملليلتر إلى 1800 نانوغرام لكل ملليلتر. باستخدام ECLIA ، تم قياس مستويات البروتين MeCP2 في الليسات النووي الدماغ من heterozygous وفئران من النوع البري الإناث ومن فأر خروج المغلوب MeCP2 واحد.تم إجراء ECLIA على الخلايا lysates من السيطرة الصحية ومن C. 806delG خط الخلية المستخدمة كنموذج لمتلازمة ريت. لم يتم الكشف عن أي بروتين MeCP2 في خطوط الخلايا المتحولة عن طريق ECLIA أو عن طريق الفلوروس.كما استُخدمت عملية الـ ECLIA للتحقيق في عملية استيعاب خط الخلية الناقص من طراز MeCP2 من قبل خط الخلية الناقصة. تم تحديد دقة ECLIA بين وداخل الفحص على مدى ثلاثة أيام متتالية. بالنسبة للعلاج ببدائل البروتين في المستقبل، يمكن تحسين تسليم MeCP2 بشكل متكرر بعد تقييم مستوى البروتين من قبل ECLIA.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

غشاء الدماغ تجزئة: أ<em&gt; إكس فيفو</em&gt; نهج لتقييم توطين البروتين سوبسينابتيك

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

سير عمل متكامل لتحديد الأيض غير المستهدف القائم على التحكم في FDR وقياسه كميا

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...