Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

Vi er dr. Brigitte Sturm meget taknemmelige for hendes støtte til ECLIA-instrumentet.

Godkendelse af indkøb af hudbiopsi til forskningsformål blev indhentet fra Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australien. Samtykke til dyreforsøg blev indhentet fra det østrigske forbundsministerium for videnskab, forskning og økonomi, som blev udført i overensstemmelse med lokale dyrevelfærdsbestemmelser (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
BEMÆRK: EcLIA-systemets princip er vist i figur 1.
1. Valg af...

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

For at måle endogenme MeCP2, rekombinant MeCP2 og TAT-MeCP2 niveauer, en 96-brønd plade ECLIA blev udviklet. Det er blevet påvist, at tab af MeCP2 proteinfunktion fører til RTT syndrom6, for hvilken behandlingen i øjeblikket er begrænset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsmulighed er den såkaldte proteinsubstitutionsterapi, hvor MeCP2-niveauerne kan titreres op til den nødvendige koncentration12,13,</s...

Elektrochemiluminescensimmunassay (ECLIA) er baseret på en proces, der udnytter etiketter designet til at udsende luminescens, når elektrokemisk stimuleret. Det er en bredt anvendelig teknik til kvantitativ påvisning af biologiske analysander i grundindustrien og akademisk forskning, fødevareindustrien samt i klinisk diagnostik1. Almindeligt, en engangs 96-brønd plade med carbon blæk elektroder anvendes. Disse elektroder fungerer som en solid fase bærer for immunassay. Et sekundært antistof er konjugeret til en elektrokælumescerende etiket, og når elektricitet påføres systemet, udløses der en letemission af kemikalieetiketten. En enhed med ultralav støj (CCD) registrerer den lysintensitet, der er direkte proportional med det antigen, der er bundet til opsamlingsantistoffet, hvilket resulterer i kvantificering af den målrettede analysand af prøven2. Sammenlignet med den enzymforbundne immunosorbentassay (ELISA) anses ECLIA for at være fordelagtig, da det giver større følsomhed og reproducerbarhed samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserede vi methyl-CpG-bindingsprotein 2 (MeCP2) i prøver af human og murine oprindelse samt forskellige varianter af rekombinantproteinet ved hjælp af det nyudviklede ECLIA-system. MecP2 er et X-forbundet nukleinsyrebindende protein, der er kendt for at interagere med methylerede DNA-sekvenser. Dette protein har været involveret i reguleringen af genekspression4,5. Tab-of-funktion mutationer i genet, som koder dette protein er de største syndere forårsager Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En anden MeCP2-relateret lidelse, MECP2 dobbeltarbejde syndrom, fører også til neurologiske symptomer, der kan overlappe med dem af RTT7. Især, kvinder er for det meste påvirket af RTT, mens mænd er for det meste ramt af MECP2 dobbeltarbejde syndrom6,7.
Disse lidelser er forbundet med utilstrækkelige eller overskydende MeCP2 niveauer henholdsvis i centralnervesystemet (CNS). Behandlingsmuligheder for RTT, der indebærer stigende MeCP2-niveauer i CNS, vil derfor skulle undgå de skadelige virkninger, der er forbundet med over mecp27. På grund af dette er en meget følsom og nøjagtig kvantificering af MeCP2-proteinniveauer, som fastsat i ECLIA-systemet, afgørende for fremme af forskning i RTT samt MECP2-duplikering. MECP2 De præcise målinger af endogene og eksogene MeCP2 niveauer fra humane cellelinjer og mus vævsprøver samt en rekombinant protein bestående af menneskelige MeCP2 isoform B (også kendt som isoform e1), og en minimal N-terminal HIV-TAT transduktion domæne (TAT-MeCP2), der har potentiale til at krydse blod-hjerne-barrieren8,,9 præsenteres i dette arbejde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

ECLIA er en alsidig metode, der er i stand til at kvantificere endogene og rekombinant proteinmængder i et 96-brøndformat. For at demonstrere ECLIA effektivitet, denne analyse blev brugt til at analysere iboende niveauer af MeCP2 i mus hjernevæv og optagelse af TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA producerer meget nøjagtige og reproducerbare målinger med lave intra- og interassayfejl. Sammenfattende udviklede vi en kvantitativ metode til evaluering af MeCP2 proteinvarianter, der kan anvendes i skærme med høj gennemløb.

Princippet om ECLIA-systemet er beskrevet i figur 1. Standardkurver for to MeCP2-varianter er vist i figur 2. Nøjagtig kvantificering var mulig over en lang række koncentrationer (1−1.800 ng/ml). I figur 3blev MeCP2-niveauet af lysater afledt af musehjerne og HDF'er analyseret. MeCP2-ekspression i hjernenukleare lysater fra heterozygote, vilde type- og knockoutmus blev sammenlignet i figur 3A, mens ...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Elektrochemiluminescensensimmunoassay (ECLIA) er en ny metode til kvantitativ påvisning af endogene og eksogent anvendte MeCP2-proteinvarianter, som producerer meget kvantitative, præcise og reproducerbare målinger med lav intra- og analysefejl over et bredt arbejdsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-godt format beskrevet.

En elektrokæminescensbaseret analyse af MeCP2-proteinvarianter

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA er en enkel, men effektiv metode til at kvantificere cellulære niveauer af MeCP2. ECLIA er hurtig, mere følsom og lettere at håndtere sammenlignet med andre kvantificeringsmetoder såsom Western blot og ELISA. For at forberede vaskeopløsningen, som er 0,5% Tween 20 i PBS, tilsættes 500 mikroliter Tween 20 til en liter PBS og blandes kraftigt.Forbered en blokerende opløsning på 3%Blocker A og PBS og rør forsigtigt. Blokeringsopløsningen steriliseres ved filtrering. For at forberede assay fortyndingsopløsningen, 1%Blocker A og PBS, tilsættes fem milliliter blokerende opløsning til 10 milliliter PBS.Næste tø monoklonale mus anti-MeCP2 antistof på is. Bland 0,67 mikroliter af antistoffet med fire milliliter PBS, så vortex opløsningen. For at opløsningen belagt 96-godt høj binde plade, omhyggeligt dispensere 25 mikroliter af belægning løsning i nederste hjørne af hver brønd, ved hjælp af en multichannel pipetter.Dup den 96-brøndsplade forsigtigt på hver side for at sikre, at belægningsopløsningen dækker bunden af hver brønd. Forsegle pladen med selvklæbende folie, og inkubere natten over ved fire grader Celsius. Hent 96-brøndspladen fra køleskabet, og tag folien ud.Fjern antistofbelægningsopløsningen i brøndene ved at svippe den ind i en affaldsbeholder. Bank derefter på pladen på en køkkenrulle for at fjerne eventuel resterende opløsning. Dernæst tilsættes 125 mikroliter af blokerende opløsning til hver brønd.Derefter forsegles pladen igen med klæbende folie. Placer pladen på en orbital mikroplade shaker, indstillet til 800 RPM, og inkuber den i 90 minutter ved stuetemperatur. Tø et hætteglas mecp2 eller Tat-MeCP2 proteinlageropløsning op på is, musehjjernelysater og HDF-lysater.Proteinlageropløsningen fortyndes i rene rør som beskrevet i tabel to af manuskriptet. Dernæst fortyndes lysateprøverne. Til musehjerne lysater skal du bruge et til 20 mikrogram pr. 25 mikroliter lysisbuffer.For HDF-lysatet tilsættes 0,25 til et mikrogram pr. 25 mikroliter lysisbuffer. Når 96-brøndpladen har inkuberet i 90 minutter, fjernes blokeringsopløsningen fra brøndene ved at svippe den ind i en affaldsbeholder. Bank derefter på pladen på en køkkenrulle for at fjerne eventuel resterende opløsning.Derefter vaskes pladen tre gange med 150 mikroliter vaskeopløsning ved at tilsætte vaskeopløsningen og straks fjerne den. Tilsæt 25 mikroliter af standarder og prøver til brøndene i 96-brøndpladen. Pladen forsegles og inkuberes i yderligere fire timer ved stuetemperatur med konstant 800 omrystning af r/min.Tø det umærkede detektionsantistof, polyklonal kanin anti-MeCP2, på is. Ved hjælp af assayfortyndingsopløsning fortyndes antistoffet i et forhold på 1 til 6.000. Når 96-brøndpladen er færdig med at inkubere på shakeren, fjernes standarderne og prøverne ved at svippe pladen ind i en affaldsbeholder.Bank derefter på pladen på en køkkenrulle for at fjerne eventuel resterende opløsning. Vask pladen tre gange med 150 mikroliter vaskeopløsning ved at tilsætte vaskeopløsningen og straks fjerne den. Der tilsættes 25 mikroliter antistofopløsning uden mærke til hver brønd med multikanalpipetteren.Pladen forsegles og inkuberes i en time ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 800 omdrejningstal. Få det specifikke sekundære antistof ud af køleskabet og læg det en is. Fortyndes den sekundære krop i assayfortyndingsopløsning og blandes forsigtigt.For at fjerne det frie ikke-mærkede detektionsantistof fra 96-brøndpladen skal du svippe ind i affaldsbeholderen og derefter trykke på pladen på en køkkenrulle. Efter vask pladen tre gange som perviously beskrevet, tilsættes 25 mikroliter af sekundært antistof til hver brønd med multikanal pipetter. Pladen forsegles og inkuberes i en time ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 800 omdrejningstal.Fjern det frie sekundære antistof ved at svippe ind i affaldsbeholderen og tappe pladen på en køkkenrulle og derefter vaske pladen tre gange, som tidligere beskrevet. Til hver brønd af pladen, tilsæt 150 mikroliter af 1X Tris base Gold Read Buffer med overfladeaktivt stof, der indeholder tripropylamin som et coreactant for lysgenerering. For at undgå at producere luftbobler, skal du bruge omvendte pipetteringsteknikker.Placer 96-brøndpladen på mikropladeplatformen med elektrokeminescensdetektionssystem. Brug den indbyggede CCD kamera, straks begynde at fange data. Optag signaltællinger, der svarer til relative lysenheder og er direkte proportionale med lysets intensitet.MeCP2 standard kurver blev genereret fra menneskelige MeCP2 i flere målinger. ECLIA kan præcist kvantificere rekombinant humant MeCP2 over et interval fra et nanogram pr. milliliter til 1800 nanogram pr. milliliter. Ved hjælp af ECLIA blev MeCP2-proteinniveauerne målt i hjerne nukleare lysater fra heterozygote og kvindelige vilde mus og fra en MeCP2 knockout-mus.ECLIA blev udført på cellelysater fra en sund kontrol og fra c. 806delG cellelinje, der anvendes som model for Rett syndrom. Der blev ikke påvist noget MeCP2-protein i de mutante cellelinjer ved ECLIA eller ved immunfluorescens.ECLIA blev også brugt til at undersøge optagelsen af Tat-MeCP2 af MeCP2 mangelfuld cellelinje overarbejde. ECLIA inter og intra assay præcision blev bestemt over tre på hinanden følgende dage. Til fremtidig proteinerstatningsterapi kan MeCP2-levering optimeres gentagne gange efter ECLIA's vurdering af proteinniveau.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraktionering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærmelse til vurdering af subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Et Fluorogenic peptid kavalergang Assay til at screene for proteolytiske aktivitet: ansøgninger om coronavirus spike protein aktivering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

En integreret arbejdsgang med identifikation og kvantificering på FDR-kontrolbaseret ikke-målrettet metabolom

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...