Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

We zijn Dr. Brigitte Sturm zeer dankbaar voor haar steun aan het ECLIA-instrument.

Goedkeuring voor huidbiopsie inkoop voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen van de Human Research Ethics Committee van het Children's Hospital in Westmead, Australië. Toestemming voor dierproeven werd verkregen van het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Economie, die werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
OPMERKING: Het beginsel van het ECLIA-systeem is afgebeeld in figuur 1<...

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Om endogene MeCP2-, recombinant MeCP2- en TAT-MeCP2-niveaus te meten, werd een 96-well plaat ECLIA ontwikkeld. Het is aangetoond dat verlies van MeCP2 eiwitfunctie leidt tot RTT-syndroom6, waarvoor de behandeling momenteel beperkt is tot symptoombestrijding en fysiotherapie. Een veelbelovende behandelingsweg is de zogenaamde eiwitvervangende therapie, waarbij MeCP2-niveaus kunnen worden getitreerd tot hun benodigde concentratie12,13,<...

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is gebaseerd op een proces dat gebruik maakt van etiketten die zijn ontworpen om luminescentie uit te stoten wanneer elektrochemisch gestimuleerd. Het is een breed toepasbare techniek voor de kwantitatieve detectie van biologische analyten in de basisindustrie en academisch onderzoek, de voedingsindustrie en in klinische diagnostiek1. Vaak wordt een wegwerp 96-well plaat met koolstofinkt elektroden gebruikt. Deze elektroden fungeren als een vaste fase drager voor de immunoassay. Een secundair antilichaam wordt geconjugeerd tot een elektrochemiluminescent label en wanneer elektriciteit wordt toegepast op het systeem, licht emissie van het chemische label wordt geactiveerd. Een ultralage geluidsbelastinggekoppelde inrichting (CCD) registreert de lichtintensiteit die rechtstreeks evenredig is met het antigeen dat aan het opname-antilichaam is gebonden, wat resulteert in de kwantificering van de beoogde analyt van het monster2. In vergelijking met de enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) wordt ECLIA als voordelig beschouwd omdat het een hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, evenals een betere automatisering en consistentie3.
Hier analyseerden we de methyl-CpG bindende eiwit 2 (MeCP2) niveaus in monsters van menselijke en murine oorsprong evenals verschillende varianten van het recombinant eiwit met behulp van de nieuw ontwikkelde ECLIA systeem. MecP2 is een X-gebonden nucleïnezuurbindende eiwit waarvan bekend is dat het interageren met gemethyleerde DNA-sequenties. Dit eiwit is betrokken bij de regulatie van genexpressie4,5. Verlies-van-functie mutaties in het gen dat dit eiwit codeert zijn de belangrijkste boosdoeners veroorzaakt Rett syndroom (RTT), een ernstige neuroontwikkelingsstoornis6. Een andere MeCP2-gerelateerde aandoening, MECP2 duplicatie syndroom, leidt ook tot neurologische symptomen die kunnen overlappen met die van RTT7. Met name worden vrouwen meestal beïnvloed door RTT, terwijl mannen6meestal worden getroffen door MECP2-duplicatiesyndroom 6,7. MECP2
Deze aandoeningen worden geassocieerd met respectievelijk onvoldoende of overtollige MeCP2-niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS). Daarom zouden behandelingsopties voor RTT die het verhogen van mecp2-niveaus in het CNS inhouden, de schadelijke effecten van een overmaat aan MeCP27moeten vermijden . Vanwege dit feit is een zeer gevoelige en nauwkeurige kwantificering van MeCP2-eiwitniveaus, zoals geboden door het ECLIA-systeem, van cruciaal belang voor de vooruitgang van RTT en mecp2-dubbelsyndroomonderzoek. De precieze metingen van endogene en exogene MeCP2-niveaus uit menselijke cellijnen en muizenweefselmonsters, evenals een recombinanteiwit bestaande uit menselijke MeCP2-isoform B (ook bekend als isoform e1), en een minimaal N-terminal HIV-TAT transductiedomein (TAT-MeCP2) dat het potentieel heeft om de bloed-hersenbarrière8over testeken,9 worden in dit werk gepresenteerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

De ECLIA is een veelzijdige methode die in staat is om endogene en recombinante eiwithoeveelheden in een 96-put formaat te kwantificeren. Om eclia-efficiëntie aan te tonen, werd deze test gebruikt om intrinsieke niveaus van MeCP2 in muishersenweefsel en de opname van TAT-MeCP2 bij menselijke huidfibroblasten te analyseren. De MeCP2-ECLIA produceert zeer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met een lage intra- en inter-assay fout. Samengevat hebben we een kwantitatieve methode ontwikkeld voor de evaluatie van MeCP2-eiwitvarianten die kunnen worden gebruikt in schermen met een hoge doorvoer.

Het beginsel van het ECLIA-systeem is beschreven in figuur 1. Standaardcurven voor twee MeCP2-varianten worden weergegeven in figuur 2. Nauwkeurige kwantificering was mogelijk over een breed scala van concentraties (1−1.800 ng/mL). In figuur 3werden MeCP2-niveaus van lysaten afgeleid van muishersenen en HDF's geanalyseerd. MeCP2-expressie in kernlysatataatstoffen in de hersenen van heterozygoot, wildtype en knock-outmuizen werden ...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

De ECLIA is een eenvoudige maar efficiënte methode om cellulaire niveaus van MeCP2 te kwantificeren. De ECLIA is snel, gevoeliger en gemakkelijker te hanteren in vergelijking met andere kwantificeringsmethoden zoals de westelijke vlek en de ELISA. Om de wasoplossing, die 0,5%Tween 20 in PBS is, voor te bereiden, voeg 500 microliter tween 20 toe aan een liter PBS en meng krachtig.Bereid een blokkeringsoplossing van 3% Blocker A en PBS voor en roer voorzichtig. Steriliseren van de blokkerende oplossing door filtratie. Om de testverwijdtingsoplossing, 1%Blocker A en PBS voor te bereiden, voegt u vijf milliliter blokkeringsoplossing toe aan 10 milliliter PBS.Vervolgens ontdooien de monoklonale muis anti-MeCP2 antilichaam op ijs. Meng 0,67 microliter van het antilichaam met vier milliliter PBS en draai de oplossing. Om de 96-goed hoge bindplaat te coaten, moet u voorzichtig 25 microliter coatingoplossing in de onderste hoek van elke put afgeven met behulp van een multichannel pipetter.Dep de 96-put plaat voorzichtig aan elke kant om ervoor te zorgen dat de coating oplossing de bodem van elke put bedekt. Verzegel de plaat met kleeffolie en broed 's nachts uit op vier graden Celsius. Haal de 96-put plaat uit de koelkast en verwijder de folie.Verwijder de antilichaamcoatingoplossing in de putten door deze in een afvalcontainer te vegen. Tik vervolgens op de plaat op een papieren handdoek om de resterende oplossing te verwijderen. Voeg vervolgens 125 microliters van blokkeren oplossing aan elke put.Sluit de plaat vervolgens opnieuw af met kleeffolie. Plaats de plaat op een orbitale microplate shaker, ingesteld op 800 RPM, en uitbroed het gedurende 90 minuten op kamertemperatuur. Ontdooi op ijs een flesje MeCP2 of Tat-MeCP2 eiwit voorraad oplossing, muis hersenlysates, en HDF lysates.Verdun de eiwitvoorraadoplossing in schone buizen zoals beschreven in tabel twee van het manuscript. Verdun vervolgens de lysaatmonsters. Gebruik voor de hersenen van de muis één tot 20 microgram per 25 microliter lysisbuffer.Voeg voor het HDF-lysaat 0,25 tot één microgram per 25 microliter lysebuffer toe. Nadat de 96-put plaat is uitbroeden voor 90 minuten, verwijder de blokkerende oplossing uit de putten door te vegen in een afvalcontainer. Tik vervolgens op de plaat op een papieren handdoek om de resterende oplossing te verwijderen.Was vervolgens de plaat drie keer met 150 microliter wasoplossing, door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen. Voeg 25 microliter aan normen en monsters toe aan de putten van de 96-putplaat. Verzegel de plaat en broed deze nog eens vier uur bij kamertemperatuur met constante 800 RPM schudden.Ontdooi het ongelabelde detectieantilichaam, polyklonal konijn anti-MeCP2, op ijs. Verdun het antilichaam met behulp van een verdunningsoplossing met behulp van een gemiddelde van één tot 6.000. Wanneer de 96-put plaat klaar is met uitbroeden op de shaker, verwijder de normen en monsters door de plaat in een afvalcontainer te vegen.Tik vervolgens op de plaat op een papieren handdoek om de resterende oplossing te verwijderen. Was de plaat drie keer met 150 microliter wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen. Voeg 25 microliters van niet-gelabelde detectie antilichaam oplossing aan elke goed met de multichannel pipetter.Verzegel de plaat en broed deze een uur bij kamertemperatuur met constant schudden bij 800 RPM. Haal het specifieke secundaire antilichaam uit de koelkast en leg het een ijs. Verdun het secundaire lichaam in een verdunningsoplossing en meng zachtjes.Om het gratis niet-gelabelde detectieantilichaam van de 96-putplaat te verwijderen, veegt u in de afvalcontainer en tikt u vervolgens op de plaat op een papieren handdoek. Na het wassen van de plaat drie keer zoals perviously beschreven, voeg 25 microliter secundaire antilichaam aan elk goed met de multichannel pipetter. Verzegel de plaat en broed deze een uur bij kamertemperatuur met constant schudden bij 800 RPM.Verwijder het vrije secundaire antilichaam door in de afvalcontainer te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken en was de plaat vervolgens drie keer, zoals eerder beschreven. Voeg aan elke put van de plaat 150 microliter 1x Tris-basis Gold Read Buffer toe met oppervlakteactieve stoffen, met tripropylamine als coreactant voor lichtgeneratie. Om te voorkomen dat het produceren van luchtbellen, gebruik maken van omgekeerde pipetting technieken.Plaats de 96-put plaat op het microplate platform met elektrochemiluminescentie detectiesysteem. Met behulp van de ingebouwde CCD-camera, onmiddellijk beginnen met het vastleggen van gegevens. Record signaal tellingen die overeenkomen met de relatieve lichteenheden en zijn direct evenredig met de intensiteit van het licht.MeCP2-standaardcurven werden gegenereerd uit menselijke MeCP2 in meerdere metingen. De ECLIA kan nauwkeurig kwantificeren recombinant menselijke MeCP2 over een bereik van een nanogram per milliliter tot 1800 nanogram per milliliter. Met behulp van ECLIA werden meCP2-eiwitniveaus gemeten in kernlysaten van heterozygoot en vrouwelijke wilde muizen en van één MeCP2 knock-outmuis.ECLIA werd uitgevoerd op cellysates van een gezonde controle en van de c. 806delG cellijn die als model voor syndroom Rett wordt gebruikt. Er werd geen MeCP2-eiwit aangetroffen in de gemuteerde cellijnen door ECLIA of door immunofluorescentie.ECLIA werd ook gebruikt om de opname van Tat-MeCP2 door de MeCP2 tekortlopende cellijn overuren te onderzoeken. De inter- en intratestprecisie van de ECLIA werd gedurende drie opeenvolgende dagen bepaald. Voor toekomstige eiwitvervangende therapie kan de meCP2-levering herhaaldelijk worden geoptimaliseerd na beoordeling van eiwitniveau door de ECLIA.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Een geïntegreerde workflow van identificatie en kwantificering op FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...