Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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Nous sommes très reconnaissants à la Dre Brigitte Sturm pour son soutien à l’instrument ECLIA.

L’approbation de l’approvisionnement en biopsie de la peau à des fins de recherche a été obtenue auprès du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Hôpital pour enfants de Westmead, en Australie. Le consentement pour les expériences animales a été obtenu auprès du Ministère fédéral autrichien des sciences, de la recherche et de l’économie, qui ont été effectués conformément aux règlements locaux sur le bien-être animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
REMARQUE ...

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Pour mesurer les niveaux endogènes MeCP2, recombinants MeCP2 et TAT-MeCP2, une plaque de 96 puits ECLIA a été développée. Il a été démontré que la perte de la fonction de protéine MeCP2 conduit au syndrome de RTT6, pour lequel le traitement est actuellement limité à la gestion des symptômes et la physiothérapie. Une avenue de traitement prometteuse est la thérapie de remplacement de protéine, où les niveaux de MeCP2 peuvent être titrés jusqu’à leur concentration nécessaire<s...

L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est basé sur un processus qui utilise des étiquettes conçues pour émettre de la luminescence lorsqu’elles sont stimulées électrochimiquement. Il s’agit d’une technique largement applicable pour la détection quantitative des analytes biologiques dans l’industrie de base et la recherche universitaire, l’industrie alimentaire ainsi que dans le diagnostic clinique1. Généralement, une plaque jetable de 96 puits avec des électrodes en encre de carbone est utilisée. Ces électrodes agissent comme un porteur de phase solide pour l’immunoassay. Un anticorps secondaire est conjugué à une étiquette électrochimique et lorsque l’électricité est appliquée au système, l’émission de lumière de l’étiquette chimique est déclenchée. Un dispositif ultra-faible de charge de bruit (CCD) enregistre l’intensité lumineuse qui est directement proportionnelle à l’antigène lié à l’anticorps de capture ayant pour résultat la quantification de l’analyte ciblé de l’échantillon2. Par rapport à l’essai immunosorbent lié à l’enzyme (ELISA), ECLIA est considéré comme avantageux car il offre une plus grande sensibilité et reproductibilité ainsi qu’une meilleure automatisation et la cohérence3.
Ici, nous avons analysé les niveaux de protéine liant méthyle-CpG 2 (MeCP2) dans des échantillons d’origine humaine et trouble ainsi que différentes variantes de la protéine recombinante utilisant le système ECLIA nouvellement développé. MecP2 est une protéine nucléique liée à l’acide X connue pour interagir avec des séquences d’ADN méthylées. Cette protéine a été impliquée dans la régulation de l’expression génique4,5. Les mutations de perte de fonction dans le gène qui code cette protéine sont les principaux coupables causant le syndrome de Rett (RTT), un désordre neurodéveloppemental grave6. Un autre trouble lié à MeCP2, syndrome de duplication MECP2, conduit également à des symptômes neurologiques qui peuvent se chevaucher avec ceux de RTT7. Notamment, les femelles sont principalement affectées par RTT tandis que les mâles sont pour la plupart affligés par le syndrome de duplication MECP2 6,7.
Ces troubles sont associés à des niveaux insuffisants ou excessifs de MeCP2 respectivement dans le système nerveux central (SNC). Par conséquent, les options de traitement pour RTT qui impliquent l’augmentation des niveaux meCP2 dans le SNC devraient éviter les effets néfastes associés à l’excès de MeCP27. En raison de ce fait, une quantification très sensible et précise des niveaux de protéines MeCP2, tel que fourni par le système ECLIA, est crucial pour l’avancement de rtT ainsi que la recherche sur le syndrome de duplication MECP2. Les mesures précises des niveaux endogènes et exogènes meCP2 des lignées cellulaires humaines et des échantillons de tissu de souris ainsi qu’une protéine recombinante composée de l’isoforme B humaine MeCP2 (également connu sous le nom d’isoforme e1), et un domaine minimal de transduction N-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) qui a le potentiel de traverser la barrière hémato-encéphalique8,,9 sont présentées dans ce travail.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

L’ECLIA est une méthode polyvalente qui est capable de quantifier les quantités de protéines endogènes et recombinantes dans un format de 96 puits. Pour démontrer l’efficacité d’ECLIA, cet essai a été employé pour analyser des niveaux intrinsèques de MeCP2 dans le tissu de cerveau de souris et l’absorption de TAT-MeCP2 dans les fibroblastes dermals humains. Le MeCP2-ECLIA produit des mesures très précises et reproductibles avec une faible erreur intra-analyse et inter-analyse. En résumé, nous avons développé une méthode quantitative pour l’évaluation des variantes de protéines MeCP2 qui peuvent être utilisées dans des écrans à haut débit.

Le principe du système ECLIA est décrit à la figure 1. Les courbes standard pour deux variantes MeCP2 sont indiquées dans la figure 2. La quantification précise était possible sur un large éventail de concentrations (1 à 1 800 ng/mL). Dans la figure 3, les niveaux de lysates meCP2 dérivés du cerveau de souris et des HDF ont été analysés. L’expression meCP2 dans les lysates nucléaires du cerveau des hétérozygotes, d...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.

Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

L’ECLIA est une méthode simple mais efficace pour quantifier les niveaux cellulaires de MeCP2. L’ECLIA est rapide, plus sensible et plus facile à manipuler par rapport à d’autres méthodes de quantification telles que la tache occidentale et l’ELISA. Pour préparer la solution de lavage, qui est de 0,5%Tween 20 en PBS, ajouter 500 microlitres de Tween 20 à un litre de PBS et mélanger vigoureusement.Préparer une solution de blocage de 3% Bloqueur A et PBS et remuer doucement. Stériliser la solution de blocage par filtration. Pour préparer la solution diluant d’essai, 1% Bloqueur A, et PBS, ajoutez cinq millilitres de solution de blocage à 10 millilitres de PBS.Ensuite, décongelez l’anticorps anti-MeCP2 de souris monoclonal sur la glace. Mélanger 0,67 microlitres de l’anticorps avec quatre millilitres de PBS, puis vortex de la solution. Pour enrober la plaque de liaison haute de 96 puits, distribuez soigneusement 25 microlitres de solution de revêtement dans le coin inférieur de chaque puits, à l’aide d’un pipetter multicanal.Tamponnez doucement la plaque de 96 puits de chaque côté pour vous assurer que la solution de revêtement couvre le fond de chaque puits. Sceller la plaque avec du papier adhésif et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Récupérer la plaque de 96 puits du réfrigérateur et retirer le papier d’aluminium.Retirez la solution de revêtement anticorps dans les puits en la faisant glisser dans un conteneur à déchets. Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante. Ensuite, ajoutez 125 microlitres de solution de blocage à chaque puits.Sceller ensuite à nouveau la plaque avec du papier adhésif. Placez la plaque sur un shaker microplaqué orbital, réglé à 800 RPM et incubez-la pendant 90 minutes à température ambiante. Décongeler sur la glace un flacon de solution de stock de protéines MeCP2 ou Tat-MeCP2, de lysates cérébraux de souris et de lysates HDF.Diluer la solution de stock de protéines dans des tubes propres tel que décrit dans le tableau deux du manuscrit. Ensuite, diluer les échantillons de lysate. Pour le cerveau de la souris lysates, utiliser un à 20 microgrammes par 25 microlitres de tampon de lyse.Pour le lysate HDF, ajouter 0,25 à un microgramme par 25 microlitres de tampon de lyse. Après l’incubation de la plaque de 96 puits pendant 90 minutes, retirez la solution de blocage des puits en la faisant glisser dans un conteneur à déchets. Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante.Lavez ensuite la plaque trois fois avec 150 microlitres de solution de lavage, en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement. Ajouter 25 microlitres de normes et d’échantillons aux puits de la plaque de 96 puits. Sceller la plaque et l’incuber pendant encore quatre heures à température ambiante avec des secousses constantes de 800 RPM.Décongeler l’anticorps de détection non étiqueté, anti-MeCP2 de lapin polyclonal, sur la glace. En utilisant la solution diluante d’essai, diluer l’anticorps à un rapport de 1 à 6000. Lorsque la plaque de 96 puits est terminée en incubation sur le shaker, retirez les normes et les échantillons en faisant glisser la plaque dans un conteneur à déchets.Puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier pour enlever toute solution restante. Lavez la plaque trois fois avec 150 microlitres de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement. Ajouter 25 microlitres de solution anticorps de détection non étiquetée à chaque puits avec le pipetter multicanal.Sceller la plaque et l’incuber pendant une heure à température ambiante avec des secousses constantes à 800 RPM. Obtenez l’anticorps secondaire spécifique du réfrigérateur et placez-le une glace. Diluer le corps secondaire dans une solution diluante d’essai et mélanger délicatement.Pour retirer l’anticorps de détection sans ceinture de la plaque de 96 puits, faites un film dans le conteneur à déchets, puis appuyez sur la plaque sur une serviette en papier. Après avoir lavé la plaque trois fois comme perviously décrit, ajouter 25 microlitres d’anticorps secondaires à chaque puits avec le pipetter multicanal. Sceller la plaque et l’incuber pendant une heure à température ambiante avec des secousses constantes à 800 RPM.Retirez l’anticorps secondaire gratuit en feuilletant dans le conteneur à déchets et en tapant la plaque sur une serviette en papier, puis lavez la plaque trois fois, comme décrit précédemment. À chaque puits de la plaque, ajouter 150 microlitres de 1X Tris base Gold Read Buffer avec surfactant, contenant de la tripropylamine comme coreactant pour la production de lumière. Pour éviter de produire des bulles d’air, utilisez des techniques de pipetage inversé.Placez la plaque de 96 puits sur la plate-forme microplaquée avec système de détection d’électrochimieluminescence. À l’aide de la caméra CCD intégrée, commencez immédiatement à capturer des données. Enregistrez les nombres de signaux qui correspondent à des unités lumineuses relatives et qui sont directement proportionnels à l’intensité de la lumière.Les courbes standard meCP2 ont été générées à partir du MeCP2 humain dans de multiples mesures. L’ECLIA peut quantifier avec précision le MeCP2 humain recombinant sur une plage d’un nanogramme par millilitre à 1800 nanogrammes par millilitre. À l’aide d’ECLIA, les niveaux de protéines MeCP2 ont été mesurés dans les lysates nucléaires du cerveau à partir d’hétérozygotes et de souris femelles de type sauvage et d’une souris KO MeCP2.ECLIA a été mené sur des lysates cellulaires à partir d’un contrôle sain et de la lignée cellulaire c. 806delG utilisée comme modèle pour le syndrome de Rett. Aucune protéine MeCP2 n’a été détectée dans les lignées cellulaires mutantes par ECLIA ou par immunofluorescence.ECLIA a également été utilisé pour étudier l’adoption de Tat-MeCP2 par la ligne cellulaire déficiente MeCP2 heures supplémentaires. Eclia entre et la précision intra-analyse a été déterminée sur trois jours consécutifs. Pour la future thérapie de remplacement des protéines, l’administration de MeCP2 peut être optimisée à plusieurs reprises après évaluation du niveau de protéines par l’ECLIA.

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Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Un flux de travail intégré d’identification et de quantification sur le métabolome non ciblé basé sur le contrôle FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...