Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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Siamo molto grati alla dott.ssa Brigitte Sturm per il suo sostegno con lo strumento ECLIA.

L'approvazione per l'approvvigionamento di biopsia cutanea a scopo di ricerca è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Ospedale pediatrico di Westmead, Australia. Il consenso per gli esperimenti sugli animali è stato ottenuto dal Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia, che sono stati effettuati in conformità con le normative locali sul benessere degli animali (G: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: il principio del sistema ECLIA è illustrat...

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Per misurare i livelli endogeni MeCP2, ricombinanti MeCP2 e TAT-MeCP2, è stato sviluppato un ECLIA a 96 pozzetti. È stato dimostrato che la perdita della funzione della proteina MeCP2 porta alla sindrome RTT6, per la quale il trattamento è attualmente limitato alla gestione dei sintomi e alla terapia fisica. Un promettente viale di trattamento è la cosiddetta terapia sostitutiva delle proteine, dove i livelli di MeCP2 possono essere titolati fino alla loro concentrazione necessaria<sup class="...

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) si basa su un processo che utilizza etichette progettate per emettere luminescenza quando stimolata elettrochimicamente. Si tratta di una tecnica ampiamente applicabile per il rilevamento quantitativo di analiti biologici nell'industria di base e nella ricerca accademica, nell'industria alimentare e nella diagnostica clinica1. Comunemente, viene utilizzata una piastra usa e getta 96 pozze con elettrodi di inchiostro di carbonio. Questi elettrodi agiscono come un vettore solido per l'immunoassay. Un anticorpo secondario viene coniugato a un'etichetta elettrochemiluminescente e quando l'elettricità viene applicata al sistema, viene attivata l'emissione di luce dell'etichetta chimica. Un dispositivo accoppiato a carica di rumore ultra-bassa (CCD) registra l'intensità della luce che è direttamente proporzionale all'antigene legato all'anticorpo di cattura con conseguente quantificazione dell'analita mirata del campione2. Rispetto all'analisi immunosorbente legata agli enzimi (ELISA), l'ECLIA è considerata vantaggiosa in quanto offre una maggiore sensibilità e riproducibilità, nonché una migliore automazione e coerenza3 .
Qui abbiamo analizzato i livelli di proteina legante metil-CpG 2 (MeCP2) in campioni di origine umana e murina, nonché diverse varianti della proteina ricombinante utilizzando il nuovo sistema ECLIA. MecP2 è una proteina legante all'acido nucleico legata all'X nota per interagire con sequenze di DNA metilato. Questa proteina è stata implicata nella regolazione dell'espressione genica4,5. Le mutazioni di perdita di funzione nel gene che codifica questa proteina sono i principali colpevoli della sindrome di Rett (RTT), un grave disturbo neurosviluppo6. Un altro disturbo correlato a MeCP2, la sindrome di duplicazione MECP2, porta anche a sintomi neurologici che possono sovrapporsi a quelli di RTT7. In particolare, le femmine sono per lo più colpite dalla RTT, mentre i maschi sono per lo più afflitti dalla sindrome di duplicazione MECP2 6,7.
Questi disturbi sono associati a livelli insufficiente o in eccesso di MeCP2 rispettivamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Di conseguenza, le opzioni di trattamento per RTT che comportano l'aumento dei livelli di MeCP2 nel SNC dovrebbero evitare gli effetti dannosi associati all'eccesso di MeCP27. A causa di questo fatto, una quantificazione altamente sensibile e accurata dei livelli di proteina MeCP2, come previsto dal sistema ECLIA, è cruciale per il progresso della RTT e la ricerca sulla sindrome di duplicazione MECP2. Le misurazioni precise dei livelli endogeni ed esogeni di MeCP2 da linee cellulari umane e campioni di tessuto murino, nonché una proteina ricombinante costituita da isoformo B umano (noto anche come isoforme e1), e un dominio minimo di trasduzione HIV-TAT N-terminal (TAT-MeCP2) che ha il potenziale di attraversare il sangue-barriera cerebrale8,9 sono presentati in questo lavoro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

L'ECLIA è un metodo versatile che è in grado di quantificare le quantità di proteine endogene e ricombinanti in un formato di 96 pozze. Per dimostrare l'efficienza dell'ECLIA, questo test è stato utilizzato per analizzare i livelli intrinseci di MeCP2 nel tessuto cerebrale del topo e l'assorbimento del TAT-MeCP2 nei fibroblasti dermici umani. Il MeCP2-ECLIA produce misurazioni altamente accurate e riproducibili con basso errore intra-e inter-ssay. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per la valutazione delle varianti proteiche MeCP2 che possono essere utilizzate in schermi ad alta velocità.

Il principio del sistema ECLIA è descritto nella Figura 1. Le curve standard per due varianti MeCP2 sono mostrate nella Figura 2. La quantificazione accurata è stata possibile su un'ampia gamma di concentrazioni (1,800 ng/mL). Nella Figura 3,sono stati analizzati i livelli MeCP2 di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF. Espressione MeCP2 in lisati nucleari cerebrali da topi eterozici, wildtype e knockout sono stati confro...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.

Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

L'ECLIA è un metodo semplice ma efficiente per quantificare i livelli cellulari di MeCP2. L'ECLIA è veloce, più sensibile e più facile da maneggiare rispetto ad altri metodi di quantificazione come la macchia occidentale e l'ELISA. Per preparare la soluzione di lavaggio, che è dello 0,5% Tween 20 in PBS, aggiungere 500 microlitri di Tween 20 a un litro di PBS e mescolare vigorosamente.Preparare una soluzione di blocco del 3%Blocker A e PBS e mescolare delicatamente. Sterilizzare la soluzione di blocco mediante filtrazione. Per preparare la soluzione diluita del test, 1%Blocker A e PBS, aggiungere cinque millilitri di soluzione di blocco a 10 millilitri di PBS.Successivamente scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio. Mescolare 0,67 microlitri dell'anticorpo con quattro millilitri di PBS, quindi vortice la soluzione. Per rivestire la piastra di legante alta 96 po', erogare con cura 25 microlitri di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo, utilizzando un pipetter multicanale.Tamponare delicatamente la piastra da 96 punti su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo. Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Recuperare la piastra da 96 pozzi dal frigorifero e rimuovere il foglio.Rimuovere la soluzione di rivestimento anticorpale nei pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Quindi, aggiungere 125 microlitri di soluzione di blocco a ciascun pozzo.Quindi sigillare nuovamente la piastra con un foglio adesivo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a micropiastra, impostata a 800 giri/min, e incubarla per 90 minuti a temperatura ambiente. Scongelare sul ghiaccio una fiala della soluzione di stock proteico MeCP2 o Tat-MeCP2, i llysati cerebrali del topo e i llysati HDF.Diluire la soluzione di stock proteico in tubi puliti come descritto nella tabella due del manoscritto. Quindi diluire i campioni di lysate. Per i liscivie cerebrali del topo, utilizzare da uno a 20 microgrammi per 25 microlitri di tampone di lisi.Per il litolato HDF, aggiungere da 0,25 a un microgrammo per 25 microlitri di tampone dilisi. Dopo che la piastra da 96 pozzetti ha incubato per 90 minuti, rimuovere la soluzione di blocco dai pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente.Quindi lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio, aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di standard e campioni ai pozzi della piastra da 96 pozza. Sigillare la piastra e incubarla per altre quattro ore a temperatura ambiente con costante scuotimento di 800 giri/min.Scongelare l'anticorpo di rilevamento non etichettato, il coniglio policlonale anti-MeCP2, sul ghiaccio. Utilizzando una soluzione diluita per test, diluire l'anticorpo con un rapporto tra uno e 6.000. Quando la piastra da 96 pozzetto ha finito di incubare sull'agitatore, rimuovere gli standard e i campioni facendo scorrere la piastra in un contenitore di rifiuti.Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di soluzione anticorpale di rilevamento senza etichetta a ciascun pozzo con il pipetter multicanale.Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min. Ottenere l'anticorpo secondario specifico dal frigorifero e posizionarlo un ghiaccio. Diluire il corpo secondario in soluzione diluita di saggio e mescolare delicatamente.Per rimuovere l'anticorpo di rilevamento libero senza etichetta dalla piastra da 96 pozzetti, scorrere nel contenitore dei rifiuti e quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta. Dopo aver lavato la piastra tre volte come descritto perviosamente, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario ad ogni pozzo con il pipetter multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min.Rimuovere l'anticorpo secondario libero facendo scorrere nel contenitore dei rifiuti e toccando la piastra su un tovagliolo di carta e quindi lavare la piastra tre volte, come descritto in precedenza. Ad ogni pozzo della piastra, aggiungere 150 microlitri di 1X Tris base Gold Read Buffer con tensioattiva, contenente tripropilammina come coreactant per la generazione di luce. Per evitare di produrre bolle d'aria, utilizzare tecniche di pipettatura inversa.Posizionare la piastra da 96 punti sulla piattaforma della micropiastra con il sistema di rilevamento dell'elettrochimica. Utilizzando la fotocamera CCD integrata, inizia immediatamente a catturare i dati. Conteggio dei segnali record che corrispondono alle unità di luce relative e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.Le curve standard MeCP2 sono state generate dal MeCP2 umano in più misurazioni. L'ECLIA può quantificare accuratamente il MeCP2 umano ricombinante su un intervallo da un nanogrammo per millilitro a 1800 nanogrammi per millilitro. Utilizzando ECLIA, i livelli di proteine MeCP2 sono stati misurati in lisati nucleari cerebrali da topi eterozigoti e femmine di tipo selvatico e da un topo knockout MeCP2.ECLIA è stato condotto su llysati cellulari da un controllo sano e dalla linea cellulare c. 806delG utilizzata come modello per la sindrome di Rett. Nessuna proteina MeCP2 è stata rilevata nelle linee cellulari mutanti dall'ECLIA o dall'immunofluorescenza.Eclia è stato anche utilizzato per studiare l'assorbimento di Tat-MeCP2 da parte del MeCP2 carente di lavoro straordinario della linea cellulare. La precisione eclia inter e intra assay è stata determinata per tre giorni consecutivi. Per la futura terapia sostitutiva delle proteine, l'erogazione di MeCP2 può essere ripetutamente ottimizzata a seguito della valutazione del livello proteico da parte dell'ECLIA.

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Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione sul metaboloma non mirato basato sul controllo FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...