Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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브리기테 스투름 박사님께 ECLIA 악기를 지원해 주신 것에 대해 매우 감사드립니다.

연구 목적을 위한 피부 생검 조달을 위한 승인은 웨스트미드에 있는 아동 병원의 인간 연구 윤리 위원회에서, 오스트레일리아에서 얻었습니다. 동물 실험에 대한 동의는 오스트리아 연방 과학 경제부에서 얻어졌으며, 이는 현지 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다(GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
참고: ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다.
<p cl...

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내인성 MeCP2, 재조합 MeCP2 및 TAT-MeCP2 수준을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 ECLIA가 개발되었습니다. MeCP2 단백질 기능의 손실은 RTT 증후군6으로이어지며, 치료는 현재 증상 관리 및 물리 치료로 제한됩니다. 1개의 유망한 처리 도로는 MeCP2 수준이 그들의 필요로 한 농도까지 적정될 수 있는 소위 단백질 대체 요법입니다12,,13,,<sup cla...

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)는 전기 화학적으로 자극 될 때 발광을 방출하도록 설계된 라벨을 활용하는 프로세스를 기반으로합니다. 그것은 임상 진단 1뿐만 아니라 기초 산업 및 학술 연구, 식품 산업에서 생물학적 분석물의 정량적 검출을 위한 광범위하게 적용 가능한기술이다. 일반적으로 탄소 잉크 전극이 있는 일회용 96웰 플레이트가 사용됩니다. 이들 전극은 면역분석에 대한 고체상 담체로서 작용한다. 이차 항체는 전기 발광 라벨에 공액되고 전기가 시스템에 가해지면 화학 라벨의 발광이 트리거됩니다. 초저잡음 전하 결합 장치(CCD)는 포획 항체에 결합된 항원과 정비례하는 광 강도를 기록하여 샘플2의표적 화된 공액을 정량화합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 비해 ECLIA는 더 높은 감도 및 재현성을 제공하며 더 나은 자동화 및 일관성3을제공함에 있어 유리한 것으로 간주됩니다.
여기서 우리는 새로 개발된 ECLIA 시스템을 사용하여 인간 및 뮤린 기원의 샘플에서 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 수준뿐만 아니라 재조합 단백질의 상이한 변이체를 분석하였다. MecP2는 메틸화된 DNA 서열과 상호 작용하는 것으로 알려진 X-연결된 핵산 결합 단백질입니다. 이 단백질은 유전자발현4,,5의조절에 연루되어 있다. 이 단백질을 부호 매코딩하는 유전자에 있는 기능 상실 돌연변이는 Rett 증후군 (RTT),6가혹한 신경 발달 무질서6를 일으키는 원인이 되는 주요 범인입니다. 또 다른 MeCP2 관련 장애, MECP2 중복 증후군, 또한 RTT의 그들과 겹칠 수 있는 신경 증상으로 이어질7. 특히, 여성은 주로 RTT에 의해 영향을받는 반면 남성은 주로 MECP2 중복 증후군6,,7에의해 고통받고 있습니다.
이러한 장애는 중추 신경계 (CNS)에서 각각 부족하거나 과잉 MeCP2 수준과 관련이 있습니다. 따라서, CNS에서 MeCP2 수준을 증가 포함 하는 RTT에 대 한 치료 옵션 MeCP2의 초과와 관련 된 해로운 효과 방지 해야 할 것 이다7. 이 사실로 인해 ECLIA 시스템에서 제공하는 MeCP2 단백질 수준의 매우 민감하고 정확한 정량화는 RTT의 발전과 MECP2 중복 증후군 연구에 매우 중요합니다. 인간 세포주 및 마우스 조직 샘플로부터 내인성 및 외인성 MeCP2 수준의 정밀한 측정은 인간 MeCP2 이소폼 B(또한 이소폼 e1라고도 함)로 구성된 재조합 단백질뿐만 아니라, 혈액-뇌장벽을,교차시킬 가능성이 있는 최소한의 N-말단 HIV-TAT 트랜스듀션 도메인(TAT-MeCP2)이 이 작업에서제시된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

ECLIA는 96 웰 포맷으로 내인성 및 재조합 단백질 양을 정량화할 수 있는 다목적 방법입니다. ECLIA 효율성을 입증하기 위해, 이 분석은 마우스 뇌 조직에서 MeCP2의 본질적인 수준을 분석하고 인간 진피 섬유아세포에서 TAT-MeCP2의 섭취를 분석하는 데 사용되었다. MeCP2-ECLIA는 낮은 분석 및 분석 간 오류로 매우 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 요약하자면, 우리는 고처리량 스크린에서 이용될 수 있는 MeCP2 단백질 변이체의 평가를 위한 정량적인 방법을 개발했습니다.

ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다. 두 개의 MeCP2 변형에 대한 표준 곡선은 그림 2에나와 있습니다. 광범위한 농도(1-1,800 ng/mL)에서 정확한 정량화가 가능했습니다. 도 3에서마우스 뇌 및 HDF에서 유래된 메CP2 수준의 포액을 분석했습니다. 이형에서의 뇌 핵 용해물에서의 MeCP2 발현, 야생형 및 녹아웃 마우스는 <strong clas...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA는 MeCP2의 세포 수준을 정량화하는 간단하면서도 효율적인 방법입니다. ECLIA는 서양 블롯 및 ELISA와 같은 다른 정량화 방법에 비해 빠르고 민감하며 취급하기가 쉽습니다. PBS에서 0.5%Tween 20인 세탁 용액을 준비하려면 500 마이크로리터의 Tween 20을 PBS 1리터에 넣고 적극적으로 혼합합니다.3%블로커 A와 PBS의 블로킹 용액을 준비하고 부드럽게 저어줍니다. 여과로 차단 용액을 살균합니다. 분석 희석 솔루션, 1%Blocker A 및 PBS를 준비하려면 PBS 의 10 밀리리터에 블로킹 솔루션 5밀리리터를 추가합니다.다음으로 얼음에 단클론 마우스 항 MeCP2 항체를 해동. 항체의 0.67 마이크로리터를 PBS의 4밀리리터와 혼합한 다음 용액을 소용돌이시다. 96웰 높이의 바인드 플레이트를 코팅하려면 멀티채널 파이퍼를 사용하여 코팅 용액 25마이크로리터를 각 웰의 하단 모서리에 조심스럽게 분배합니다.코팅 용액이 각 우물의 바닥을 덮는지 확인하기 위해 각 면에 96 웰 플레이트를 부드럽게 두드려. 접착제 호일로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 냉장고에서 96웰 플레이트를 회수하고 호일을 제거합니다.이를 폐기물 용기로 밀어 서 우물내의 항체 코팅 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 다음으로 각 웰에 125마이크로리터의 블로킹 솔루션을 추가합니다.그런 다음 접착제 호일로 접시를 다시 밀봉합니다. 800 RPM에 설정된 궤도 마이크로 플레이트 셰이커에 플레이트를 놓고 실온에서 90분 동안 배양합니다. MeCP2 또는 Tat-MeCP2 단백질 스톡 솔루션, 마우스 뇌 용액 및 HDF 용액의 얼음 1부 바이알을 얼음 위에 해동합니다.원고의 표 2에 설명된 대로 깨끗한 튜브에 단백질 스톡 용액을 희석시. 다음으로 lysate 샘플을 희석시. 마우스 뇌 용해물의 경우, 용해 버퍼의 25 마이크로 리터 당 1 ~ 20 마이크로 그램을 사용합니다.HDF 용액의 경우 25마이크로리터당 0.25마이크로그램에 1마이크로그램을 추가합니다. 96웰 플레이트가 90분 동안 배양한 후, 이를 폐기물 용기로 밀어서 우물에서 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다.그런 다음 세척 용액 150 마이크로리터로 플레이트를 세 번 씻고 즉시 제거하십시오. 96웰 플레이트의 우물에 표준 및 샘플 25 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 일정한 800 RPM 흔들림과 실온에서 또 다른 4 시간 동안 인큐베이션.표지가 없는 검출 항체, 폴리클론 토끼 항-MeCP2를 얼음 위에 해동하십시오. 분석 희석용액을 사용하여, 항체를 1 대 6, 000의 비율로 희석한다. 96웰 플레이트가 셰이커에 인큐베이팅이 완료되면 플레이트를 폐기물 용기에 밀어 서 표준 및 샘플을 제거합니다.그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 마이크로 리터의 세척 용액으로 접시를 세 번 씻습니다. 다중 채널 파이퍼를 사용하여 라벨이 부착되지 않은 검출 항체 용액 25마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 냉장고에서 특정 이차 항체를 얻고 하나의 얼음을 놓습니다. 보조 바디를 분석 희석 용액으로 희석하고 부드럽게 섞습니다.96웰 플레이트에서 라벨이 없는 무료 검출 항체를 제거하려면 폐기물 용기에 넣은 다음 종이 타월에 접시를 누릅니다. 플레이트를 3배 나 세척한 후, 멀티채널 파이프터와 함께 각각 25마이크로리터의 이차 항체를 첨가한다. 접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.폐기물 용기에 넣고 종이 타월에 접시를 두드리고 이전에 설명한 대로 플레이트를 세 번 세척하여 자유 이차 항체를 제거합니다. 플레이트의 각 웰에, 150 마이크로 리터의 150 계면 활성제로 골드 읽기 버퍼, 광 생성을위한 코어 액터로 트리 프로필라민을 포함. 기포를 생성하지 않으려면 역파이프팅 기술을 사용하십시오.전기 화학 발광 검출 시스템을 갖춘 마이크로 플레이트 플랫폼에 96웰 플레이트를 배치합니다. 내장된 CCD 카메라를 사용하여 즉시 데이터 캡처를 시작합니다. 상대광 단위에 대응하고 빛의 강도에 직접 비례하는 기록 신호 카운트.MeCP2 표준 곡선은 여러 측정에서 인간 MeCP2로부터 생성되었습니다. ECLIA는 밀리리터당 1나노그램에서 밀리리터당 1800나노그램의 범위에서 재조합 인간 MeCP2를 정확하게 정량화할 수 있습니다. ECLIA를 사용하여, MeCP2 단백질 수준은 이종화구와 여성 야생형 마우스와 1개의 MeCP2 녹아웃 마우스에서 두뇌 핵 용액에서 측정되었습니다.ECLIA는 건강한 대조군으로부터 세포 용액및 레트 증후군의 모델로 사용되는 c. 806delG 세포주로부터 수행되었다. ECLIA 또는 면역 형광에 의해 돌연변이 세포주에서 MeCP2 단백질이 검출되지 않았다.ECLIA는 또한 MeCP2 결핍 세포주 초과 근무에 의해 Tat-MeCP2의 uptake를 조사하는 데 사용되었다. ECLIA 인터 및 내 분석 정밀도는 3일 연속 으로 결정되었다. 미래의 단백질 대체 요법을 위해, MeCP2 전달은 ECLIA에 의하여 단백질 수준 평가에 따라 반복적으로 최적화될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

연구

생화학

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

FDR 제어 기반 비표적 메타볼로임에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...