Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

Vi er veldig takknemlige til Dr. Brigitte Sturm for hennes støtte til ECLIA-instrumentet.

Godkjenning for hudbiopsianskaffelser for forskningsformål ble innhentet fra Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australia. Samtykke til dyreforsøk ble innhentet fra det østerrikske føderale vitenskaps-, forsknings- og økonomidepartementet, som ble utført i samsvar med lokale dyrevelferdsforskrifter (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
MERK: Prinsippet i ECLIA-systemet er avbildet i figur 1.
1. Valg av an...

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

For å måle endogene MeCP2- og TAT-MeCP2-nivåer ble det utviklet en 96-brønnplate ECLIA. Det har vist seg at tap av MeCP2 proteinfunksjon fører til RTT syndrom6, for hvilken behandling er for tiden begrenset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsvei er den såkalte proteinerstatningsterapien, hvor MeCP2-nivåer kan titreres opp til deres nødvendige konsentrasjon12,,13,14,</...

Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er basert på en prosess som benytter etiketter designet for å avgi luminescens når elektrokjemisk stimulert. Det er en bredt anvendelig teknikk for kvantitativ påvisning av biologiske analytter i grunnleggende industri og akademisk forskning, næringsmiddelindustrien samt i klinisk diagnostikk1. Vanligvis brukes en engangs 96-brønnplate med karbonblekkelektroder. Disse elektrodene fungerer som en solid fase bærer for immunoassay. Et sekundært antistoff er konjugert til en elektrochemiluminescerende etikett, og når elektrisitet påføres systemet, utløses lettutslipp av den kjemiske etiketten. En ultra-lav støy lade-koblet enhet (CCD) registrerer lysintensiteten som er direkte proporsjonal med antigenet bundet til fangstantistoffet som resulterer i kvantifisering av den målrettede aalyten til prøven2. Sammenlignet med enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA), anses ECLIA å være fordelaktig, da det gir høyere følsomhet og reproduserbarhet samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserte vi metyl-CpG bindingprotein 2 (MeCP2) nivåer i prøver av menneskelig og murine opprinnelse samt ulike varianter av rekombinant protein ved hjelp av det nyutviklede ECLIA-systemet. MecP2 er et X-koblet nukleinsyrebindende protein som er kjent for å samhandle med metylerte DNA-sekvenser. Dette proteinet har vært innblandet i reguleringen av genuttrykk4,5. Tap av funksjon mutasjoner i genet som koder dette proteinet er de viktigste skyldige forårsaker Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En annen MeCP2-relatert lidelse, MECP2 dupliseringssyndrom, fører også til nevrologiske symptomer som kan overlappe med rtt7. Spesielt er kvinner for det meste påvirket av RTT mens menn er for det meste plaget av MECP2 dupliseringsyndrom6,7.
Disse lidelsene er forbundet med henholdsvis utilstrekkelige eller overskytende MeCP2-nivåer i sentralnervesystemet (CNS). Behandlingsalternativer for RTT som involverer økende MeCP2-nivåer i CNS må derfor unngå de skadelige effektene forbundet med overskudd av MeCP27. På grunn av dette faktum er en svært følsom og nøyaktig kvantifisering av MeCP2 proteinnivåer, som gitt av ECLIA-systemet, avgjørende for utviklingen av RTT samt MECP2 dupliseringsyndromforskning. De nøyaktige målingene av endogene og eksogene MeCP2-nivåer fra humancellelinjer og musevevsprøver samt et rekombinant protein bestående av humanmeCP2 isoform B (også kjent som isoform e1), og et minimalt N-terminal HIV-TAT transduksjonsdomene (TAT-MeCP2) som har potensial til å krysse blod-hjerne-barriere8,,9 er presentert i dette arbeidet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

ECLIA er en allsidig metode som er i stand til å kvantifisere endogene og rekombinant proteinmengder i et 96-brønnformat. For å demonstrere ECLIA effektivitet, denne analysen ble brukt til å analysere iboende nivåer av MeCP2 i mus hjernevev og opptaket av TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA produserer svært nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og interanalysefeil. Oppsummert utviklet vi en kvantitativ metode for evaluering av MeCP2 proteinvarianter som kan brukes i skjermer med høy gjennomstrømning.

Prinsippet i ECLIA-systemet er beskrevet i figur 1. Standardkurver for to MeCP2-varianter vises i figur 2. Nøyaktig kvantifisering var mulig over et bredt spekter av konsentrasjoner (1-1800 ng/ml). I figur 3ble MeCP2-nivåene av lysater avledet fra mushjerne og HDF-er analysert. MeCP2-uttrykk i hjernens kjernefysiske lysater fra heterozygotere, villtype og knockoutmus ble sammenlignet i figur 3A, mens ...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er en ny tilnærming for kvantitativ påvisning av endogene og eksogene brukte MeCP2 proteinvarianter, som produserer svært kvantitative, nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og inter-analyse feil over et bredt arbeidsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-brønnformat beskrevet.

En elektrochemiluminescensbasert analyse for MeCP2 proteinvarianter

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA er en enkel, men effektiv metode for å kvantifisere cellulære nivåer av MeCP2. ECLIA er rask, mer følsom og lettere å håndtere sammenlignet med andre kvantifiseringsmetoder som den vestlige flekken og ELISA. For å forberede vaskeløsningen, som er 0,5% Tween 20 i PBS, legg til 500 mikroliter Tween 20 til en liter PBS og bland kraftig.Forbered en blokkeringsløsning på 3% Blocker A og PBS og rør forsiktig. Steriliser blokkeringsløsningen ved filtrering. For å klargjøre analyse fortynningsvæskeløsningen, 1% Blocker A og PBS, legg til fem milliliter med blokkeringsløsning til 10 milliliter PBS.Deretter tine monoklonal mus anti-MeCP2 antistoff på is. Bland 0,67 mikroliter av antistoffet med fire milliliter PBS, og vortex oppløsningen. For å få den 96-brønns høye bindplaten, må du forsiktig dispensere 25 mikroliter beleggoppløsning i nederste hjørne av hver brønn, ved hjelp av en flerkanals pipetter.Dab 96-brønnsplaten forsiktig på hver side for å sikre at beleggoppløsningen dekker bunnen av hver brønn. Forsegle platen med klebende folie, og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Trekk 96-brønnplaten ut av kjøleskapet og fjern folien.Fjern antistoffbelegget i brønnene ved å bla den inn i en avfallsbeholder. Trykk deretter på platen på et papirhåndkle for å fjerne eventuell gjenværende løsning. Deretter legger du til 125 mikroliter med blokkeringsløsning til hver brønn.Tet deretter platen igjen med klebende folie. Plasser platen på en orbital mikroplateshaker, sett til 800 O/min, og inkuber den i 90 minutter ved romtemperatur. Tin på is ett hetteglass med MeCP2 eller Tat-MeCP2 protein lagerløsning, mus hjerne lysates, og HDF lysates.Fortynn proteinlagerløsningen i rene rør som beskrevet i tabell to av manuskriptet. Deretter fortynner lysateprøvene. For musen hjernen lysates, bruk en til 20 mikrogram per 25 mikroliter lysis buffer.For HDF-lysatet legger du til 0,25 til ett mikrogram per 25 mikroliter lysisbuffer. Etter at 96-brønnsplaten har ruget i 90 minutter, fjerner du blokkeringsløsningen fra brønnene ved å sveipe den inn i en avfallsbeholder. Trykk deretter på platen på et papirhåndkle for å fjerne eventuell gjenværende løsning.Vask deretter platen tre ganger med 150 mikroliter vaskeoppløsning, ved å legge til vaskeoppløsningen og umiddelbart fjerne den. Tilsett 25 mikroliter med standarder og prøver i brønnene på 96-brønnplaten. Forsegle platen og inkuber den i ytterligere fire timer ved romtemperatur med konstant risting på 800 o/min.Tin det umerkede deteksjonsantistoffet, polyklonal kanin anti-MeCP2, på is. Bruk analysefortynningsmiddeloppløsning, fortynne antistoffet i forholdet mellom en til 6 000. Når 96-brønnsplaten er ferdig med å inkubere på risteren, fjerner du standardene og prøvene ved å sveipe platen inn i en avfallsbeholder.Trykk deretter på platen på et papirhåndkle for å fjerne eventuell gjenværende løsning. Vask platen tre ganger med 150 mikroliter vaskeoppløsning ved å tilsette vaskeoppløsningen og umiddelbart fjerne den. Tilsett 25 mikroliter med umerkede deteksjonsantistoffoppløsning til hver brønn med flerkanalspipetteren.Forsegle platen og inkuber den i en time ved romtemperatur med konstant risting ved 800 RPM. Få det spesifikke sekundære antistoffet fra kjøleskapet og plasser det en is. Fortynn den sekundære kroppen i analysefortynningsmiddeloppløsning og bland forsiktig.Hvis du vil fjerne det frie, umerkede deteksjonsantistoffet fra 96-brønnplaten, sveiper du inn i avfallsbeholderen og trykker deretter platen på et papirhåndkle. Etter å ha vasket platen tre ganger så perviously beskrevet, tilsett 25 mikroliter sekundært antistoff til hver brønn med flerkanals pipetter. Forsegle platen og inkuber den i en time ved romtemperatur med konstant risting ved 800 RPM.Fjern det frie sekundære antistoffet ved å bla inn i avfallsbeholderen og banke platen på et papirhåndkle og vask deretter platen tre ganger, som tidligere beskrevet. Til hver brønn av platen, tilsett 150 mikroliter av 1X Tris base Gold Read Buffer med overflateaktivt middel, som inneholder tripropyamin som en kjerneaktant for lysgenerering. For å unngå å produsere luftbobler, bruk omvendt pipetteringsteknikker.Plasser 96-brønnsplaten på mikroplateplattformen med elektrokjemiluminescensdeteksjonssystem. Bruk det innebygde CCD-kameraet til å umiddelbart begynne å fange opp data. Registrer signaltellinger som tilsvarer relative lysenheter og er direkte proporsjonale med lysets intensitet.MeCP2 standardkurver ble generert fra human MeCP2 i flere målinger. ECLIA kan nøyaktig kvantifisere rekombinant human MeCP2 over et område fra ett nanogram per milliliter til 1800 nanogram per milliliter. Ved hjelp av ECLIA ble MeCP2-proteinnivåer målt i kjernefysiske lysater fra heterozygous og kvinnelige villtypemus og fra en MeCP2 knockout-mus.ECLIA ble utført på cellelylater fra en sunn kontroll og fra c. 806delG cellelinjen som brukes som modell for Rett syndrom. Ingen MeCP2-protein ble påvist i muterte cellelinjer av ECLIA eller ved immunofluorescence.ECLIA ble også brukt til å undersøke opptaket av Tat-MeCP2 av MeCP2 mangelfull cellelinje overtid. ECLIA inter og intra analyse presisjon ble bestemt over tre påfølgende dager. For fremtidig proteinerstatningsbehandling kan MeCP2-levering optimaliseres gjentatte ganger etter vurdering av proteinnivå av ECLIA.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraksjonering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærming til vurdering av subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

En Fluorogenic peptid Cleavage analysen til skjermen for proteolytiske: programmer for coronavirus pigge protein aktivisering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

En integrert arbeidsflyt for identifisering og kvantifisering på FDR-kontrollbasert ikke-målrettet metabolom

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...