Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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Somos muito gratos à Dra.

A aprovação para aquisição de biópsias de pele para fins de pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Infantil de Westmead, Austrália. O consentimento para experimentos em animais foi obtido do Ministério da Ciência, Pesquisa e Economia da Áustria, realizado de acordo com as normas locais de bem-estar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: O princípio do sistema ECLIA é retratado na Figura 1.
1...

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	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. 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J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Para medir os níveis endógenos de MeCP2, MeCP2 recombinante e TAT-MeCP2, foi desenvolvida uma placa eclia de 96 poços. Foi demonstrado que a perda da função proteica MeCP2 leva à síndrome de TRT6, para a qual o tratamento está atualmente limitado ao gerenciamento de sintomas e fisioterapia. Um caminho promissor para o tratamento é a chamada terapia de reposição de proteínas, onde os níveis de MeCP2 podem ser titulados até a concentração necessária12,</...

O imunoensaio eletroqueiluminescência (ECLIA) baseia-se em um processo que utiliza rótulos projetados para emitir luminescência quando estimulados eletroquimicamente. É uma técnica amplamente aplicável para a detecção quantitativa de analitos biológicos na indústria básica e na pesquisa acadêmica, na indústria alimentícia, bem como nos diagnósticos clínicos1. Comumente, uma placa descartável de 96 poços com eletrodos de tinta de carbono é usada. Estes eletrodos agem como um portador de fase sólida para o imunoensaio. Um anticorpo secundário é conjugado a um rótulo eletroquímico e quando a eletricidade é aplicada ao sistema, a emissão de luz da etiqueta química é acionada. Um dispositivo de carga de ruído ultra-baixo (CCD) registra a intensidade da luz que é diretamente proporcional ao antígeno ligado ao anticorpo de captura, resultando na quantificação do analito alvo da amostra2. Em comparação com o ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA), o ECLIA é considerado vantajoso, pois oferece maior sensibilidade e reprodutibilidade, bem como melhor automação e consistência3.
Aqui analisamos os níveis de proteína de ligação metil-CpG 2 (MeCP2) em amostras de origem humana e murina, bem como diferentes variantes da proteína recombinante usando o recém-desenvolvido sistema ECLIA. MECP2 é uma proteína de ligação de ácido nucleico ligada a X conhecida por interagir com seqüências de DNA metilados. Esta proteína foi implicada na regulação da expressão genética4,5. Mutações de perda de função no gene que codifica essa proteína são os principais culpados pela síndrome de Rett (TRT), uma grave desordem neurodesenvolvimentista6. Outro distúrbio relacionado ao MECP2, a síndrome da duplicação do MECP2, também leva a sintomas neurológicos que podem se sobrepor aos da TRT7. Notavelmente, as fêmeas são mais afetadas pela TT, enquanto os machos são mais acometidos pela síndrome de duplicação MECP2 6,7.
Esses transtornos estão associados a níveis insuficientes ou excessivos de MeCP2, respectivamente, no sistema nervoso central (SNC). Assim, as opções de tratamento para tRT que envolvem o aumento dos níveis de MeCP2 no CNS precisariam evitar os efeitos prejudiciais associados ao excesso de MECP27. Devido a esse fato, uma quantificação altamente sensível e precisa dos níveis de proteína MeCP2, conforme fornecido pelo sistema ECLIA, é crucial para o avanço da TRT, bem como a pesquisa da síndrome da duplicação mecp2. As medidas precisas dos níveis endógenos e exógenos de MeCP2 de linhas de células humanas e amostras de tecido de camundongos, bem como uma proteína recombinante composta pelo isoform ebeuco B humano MeCP2 (também conhecido como isoform e1), e um domínio mínimo de transdução n-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) que tem o potencial de atravessar abarreirahemato-cérebro-8,9 são apresentadas neste trabalho.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

O ECLIA é um método versátil que é capaz de quantificar quantidades de proteínas endógenas e recombinantes em um formato de 96 poços. Para demonstrar a eficiência do ECLIA, este ensaio foi utilizado para analisar os níveis intrínsecos de MeCP2 no tecido cerebral do camundongo e a captação de TAT-MeCP2 em fibroblastos dérmicos humanos. O MeCP2-ECLIA produz medidas altamente precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio. Em resumo, desenvolvemos um método quantitativo para a avaliação de variantes proteicas MeCP2 que podem ser utilizadas em telas de alto throughput.

O princípio do sistema ECLIA é descrito na Figura 1. As curvas padrão para duas variantes MeCP2 são mostradas na Figura 2. A quantificação precisa foi possível em uma ampla gama de concentrações (1-1.800 ng/mL). Na Figura 3,foram analisados os níveis de Lnadameado derivados do cérebro do rato e dos HDFs. A expressão mecp2 em lisatos nucleares cerebrais de camundongos heterozigos, selvagens e camundongos nocauteados foi c...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

O ECLIA é um método simples, mas eficiente, para quantificar os níveis celulares de MeCP2. O ECLIA é rápido, mais sensível e mais fácil de manusear em comparação com outros métodos de quantificação, como a mancha ocidental e a ELISA. Para preparar a solução de lavagem, que é 0,5%Tween 20 em PBS, adicione 500 microliters de Tween 20 a um litro de PBS e misture vigorosamente.Prepare uma solução de bloqueio de 3% Bloqueador A e PBS e mexa suavemente. Esterilize a solução de bloqueio por filtragem. Para preparar a solução diluente de ensaio, 1%Blocker A e PBS, adicione cinco mililitros de solução de bloqueio a 10 mililitros de PBS.Em seguida, descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo. Misture 0,67 microliters do anticorpo com quatro mililitros de PBS, depois vórtice da solução. Para a solução revestir a placa de ligação de 96 poços, dispense cuidadosamente 25 microliters de solução de revestimento no canto inferior de cada poço, usando um pipetter multicanal.Dab a placa de 96 poços suavemente de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço. Sele a placa com papel alumínio adesivo e incuba durante a noite a quatro graus Celsius. Retire a placa de 96 poços da geladeira e retire a folha.Remova a solução de revestimento de anticorpos nos poços, jogando-a em um recipiente de resíduos. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Em seguida, adicione 125 microliters de solução de bloqueio a cada poço.Em seguida, sele novamente a placa com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de microplaco orbital, fixado em 800 RPM, e incuba-a por 90 minutos em temperatura ambiente. Descongele no gelo um frasco de solução de estoque de proteínas MeCP2 ou Tat-MeCP2, lises cerebrais de camundongos e lisess hdf.Diluir a solução de estoque de proteínas em tubos limpos, conforme descrito na tabela dois do manuscrito. Em seguida, diluir as amostras de lise. Para os lises cerebrais do camundongo, use de um a 20 microgramas por 25 microliters de tampão de lise.Para o hdf lysate, adicione 0,25 a um micrograma por 25 microliters de tampão de lise. Depois que a placa de 96 poços estiver incubada por 90 minutos, remova a solução de bloqueio dos poços, jogando-a em um recipiente de lixo. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante.Em seguida, lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem, adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de padrões e amostras aos poços da placa de 96 poços. Sele a placa e incuba-a por mais quatro horas em temperatura ambiente com constantes tremores de 800 RPM.Descongele o anticorpo de detecção não rotulado, coelhinho policlonal anti-MeCP2, no gelo. Utilizando solução diluída de ensaio, diluir o anticorpo em uma proporção de um a 6.000. Quando a placa de 96 poços terminar de incubar no agitador, remova os padrões e amostras, jogando a placa em um recipiente de resíduos.Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de solução de anticorpos de detecção sem rótulo para cada poço com o pipetter multicanal.Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM. Obtenha o anticorpo secundário específico da geladeira e coloque-o um gelo. Diluir o corpo secundário na solução diluída do ensaio e misture suavemente.Para remover o anticorpo de detecção sem rótulo livre da placa de 96 poços, entre no recipiente de resíduos e, em seguida, bata a placa em uma toalha de papel. Depois de lavar a placa três vezes como descrito perviosamente, adicione 25 microliters de anticorpo secundário a cada poço com o pipetter multicanal. Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM.Remova o anticorpo secundário livre, clicando no recipiente de lixo e batendo na placa em uma toalha de papel e, em seguida, lave a placa três vezes, como descrito anteriormente. A cada poço da placa, adicione 150 microlitadores de 1X Tris base Gold Read Buffer com surfactante, contendo tripropilamina como um coreactante para geração de luz. Para evitar produzir bolhas de ar, use técnicas de tubulação reversa.Coloque a placa de 96 poços na plataforma de microplaca com sistema de detecção de eletroquimiluminascência. Usando a câmera CCD incorporada, comece imediatamente a capturar dados. Contagem de sinais de registro que correspondem a unidades de luz relativas e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.As curvas padrão MeCP2 foram geradas a partir de MeCP2 humano em múltiplas medições. O ECLIA pode quantificar com precisão meCP2 humano recombinante sobre uma faixa de um nanograma por mililitro a 1800 nanogramas por mililitro. Usando ECLIA, os níveis de proteína MeCP2 foram medidos em lises nucleares cerebrais de camundongos heterozigosos e fêmeas e de um rato-nocaute MeCP2.O ECLIA foi conduzido em lisescelulares a partir de um controle saudável e da linha celular c. 806delG usada como modelo para síndrome de Rett. Nenhuma proteína MeCP2 foi detectada nas linhas celulares mutantes pela ECLIA ou por imunofluorescência.O ECLIA também foi usado para investigar a absorção de Tat-MeCP2 pela linha de celular deficiente MeCP2 horas extras. A precisão eclia inter e intra ensaio foi determinada ao longo de três dias consecutivos. Para futura terapia de substituição de proteínas, a entrega de MeCP2 pode ser repetidamente otimizada após a avaliação do nível de proteína pela ECLIA.

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Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...