Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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Estamos muy agradecidos a la Dra. Brigitte Sturm por su apoyo con el instrumento ECLIA.

La aprobación para la adquisición de biopsias de piel con fines de investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación humana del Hospital de Niños en Westmead, Australia. El consentimiento para experimentos con animales se obtuvo del Ministerio Federal de Ciencia, Investigación y Economía de Austria, que se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: El principio del sistema ECLIA se muestra en <strong class="xfi...

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Para medir los niveles endógenos de MeCP2, MeCP2 y TAT-MeCP2, se desarrolló una placa de 96 pocillos ECLIA. Se ha demostrado que la pérdida de la función proteica MeCP2 conduce al síndrome de RTT6,para lo cual el tratamiento se limita actualmente al manejo de síntomas y terapia física. Una vía de tratamiento prometedora es la llamada terapia de reemplazo de proteínas, donde los niveles de MeCP2 se pueden valorar hasta su concentración necesaria12,,<sup ...

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) se basa en un proceso que utiliza etiquetas diseñadas para emitir luminiscencia cuando se estimula electroquímicamente. Es una técnica ampliamente aplicable para la detección cuantitativa de analitos biológicos en la industria básica y la investigación académica, la industria alimentaria, así como en el diagnóstico clínico1. Comúnmente, se utiliza una placa desechable de 96 pocillos con electrodos de tinta de carbono. Estos electrodos actúan como un portador de fase sólida para el inmunoensayo. Un anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta electroquimioluminiscente y cuando se aplica electricidad al sistema, se desencadena la emisión de luz de la etiqueta química. Un dispositivo acoplado a carga de ruido ultrabajo (CCD) registra la intensidad de la luz que es directamente proporcional al antígeno enlazado al anticuerpo de captura, lo que resulta en la cuantificación del analito objetivo de la muestra2. En comparación con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ECLIA se considera ventajoso, ya que ofrece una mayor sensibilidad y reproducibilidad, así como una mejor automatización y consistencia3.
Aquí analizamos los niveles de proteína de unión metil-CpG 2 (MeCP2) en muestras de origen humano y murino, así como diferentes variantes de la proteína recombinante utilizando el sistema ECLIA recién desarrollado. MecP2 es una proteína de unión a ácido nucleico ligada al X que se sabe que interactúa con secuencias de ADN metiladas. Esta proteína ha estado implicada en la regulación de la expresión génica4,5. Las mutaciones de pérdida de función en el gen que codifica esta proteína son los principales culpables que causan el síndrome de Rett (RTT), un trastorno grave del neurodesarrollo6. Otro trastorno relacionado con MeCP2, el síndrome de duplicación MECP2, también conduce a síntomas neurológicos que pueden superponerse con los de RTT7. En particular, las hembras se ven afectadas principalmente por la RTT, mientras que los machos se ven afectados en su mayoría por el síndrome de duplicación MECP2 6,7.
Estos trastornos se asocian con niveles insuficientes o excesivos de MeCP2 respectivamente en el sistema nervioso central (SNC). Por lo tanto, las opciones de tratamiento para la RTT que implican el aumento de los niveles de MeCP2 en el SNC tendrían que evitar los efectos perjudiciales asociados con el exceso de MeCP27. Debido a este hecho, una cuantificación altamente sensible y precisa de los niveles de proteína MeCP2, según lo proporcionado por el sistema ECLIA, es crucial para el avance de la RTT, así como la investigación del síndrome de duplicación MECP2. Las mediciones precisas de los niveles endógenos y exógenos de MeCP2 a partir de líneas celulares humanas y muestras de tejido de ratón, así como una proteína recombinante que consiste en isoforma B mecp2 humana (también conocida como isoforma e1), y un dominio mínimo de transducción N-terminal VIH-TAT (TAT-MeCP2) que tiene el potencial de cruzar la barrera hemorrágucciona-cerebro8,9 se presentan en este trabajo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

El ECLIA es un método versátil que es capaz de cuantificar cantidades de proteínaendógenas y recombinantes en un formato de 96 pozos. Para demostrar la eficiencia de ECLIA, este ensayo se utilizó para analizar los niveles intrínsecos de MeCP2 en el tejido cerebral del ratón y la aceptación de TAT-MeCP2 en fibroblastos dérmales humanos. El MeCP2-ECLIA produce mediciones altamente precisas y reproducibles con un error bajo de intra e interensayo. En resumen, desarrollamos un método cuantitativo para la evaluación de variantes de proteínaMeCP2 que se puede utilizar en pantallas de alto rendimiento.

El principio del sistema ECLIA se describe en la Figura 1. Las curvas estándar para dos variantes de MeCP2 se muestran en la Figura 2. La cuantificación precisa fue posible en una amplia gama de concentraciones (1-1.800 ng/mL). En la Figura 3,se analizaron los niveles de meCP2 de lisados derivados del cerebro del ratón y los HDF. La expresión de MeCP2 en los licentos nucleares cerebrales de ratones heterocigotos, salvajes y noqu...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.

Un ensayo basado en electroquimioluminiscencia para variantes de proteínames MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

El ECLIA es un método simple pero eficiente para cuantificar los niveles celulares de MeCP2. El ECLIA es rápido, más sensible y más fácil de manejar en comparación con otros métodos de cuantificación como la mancha occidental y el ELISA. Para preparar la solución de lavado, que es 0.5%Tween 20 en PBS, añadir 500 microlitros de Tween 20 a un litro de PBS y mezclar vigorosamente.Prepare una solución de bloqueo de 3%Blocker A y PBS y revuelva suavemente. Esterilice la solución de bloqueo por filtración. Para preparar la solución diluyente del ensayo, 1%Blocker A y PBS, agregue cinco mililitros de solución de bloqueo a 10 mililitros de PBS.A continuación, descongele el anticuerpo anti-MeCP2 del ratón monoclonal sobre el hielo. Mezclar 0,67 microlitros del anticuerpo con cuatro mililitros de PBS, luego vórtice la solución. Para recubrir la solución de la placa de unión de 96 pozos de altura, dispensar cuidadosamente 25 microlitros de solución de recubrimiento en la esquina inferior de cada pozo, utilizando una pipeta multicanal.Coloque suavemente la placa de 96 pozos en cada lado para asegurarse de que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de cada pozo. Selle la placa con papel adhesivo e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Recupere la placa de 96 pozos del refrigerador y retire la lámina.Retire la solución de recubrimiento de anticuerpos en los pozos arrojándola en un contenedor de residuos. A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante. A continuación, agregue 125 microlitros de solución de bloqueo a cada pozo.A continuación, vuelva a sellar la placa con papel adhesivo. Coloque la placa en un agitador de microplacas orbital, fijado a 800 RPM, e incubarlo durante 90 minutos a temperatura ambiente. Descongelar sobre hielo un vial de solución de stock de proteína MeCP2 o Tat-MeCP2, lesates cerebrales de ratón y lesates HDF.Diluir la solución de proteína en tubos limpios como se describe en la tabla dos del manuscrito. A continuación, diluya las muestras de izado. Para las lesates cerebrales del ratón, utilice de uno a 20 microgramos por cada 25 microlitros de tampón de lelisis.Para el alate HDF, agregue 0.25 a un microgramo por cada 25 microlitros de tampón de lelisis. Después de que la placa de 96 pozos haya estado incubando durante 90 minutos, retire la solución de bloqueo de los pozos arrojándola en un contenedor de residuos. A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante.A continuación, lave la placa tres veces con 150 microlitros de solución de lavado, añadiendo la solución de lavado y quitándola inmediatamente. Añadir 25 microlitros de estándares y muestras a los pozos de la placa de 96 pozos. Selle la placa e i incuba durante otras cuatro horas a temperatura ambiente con un agitado constante de 800 RPM.Descongelar el anticuerpo de detección sin etiquetar, conejo policlonal anti-MeCP2, sobre hielo. Utilizando la solución diluyente del ensayo, diluya el anticuerpo en una proporción de uno a 6.000. Cuando la placa de 96 pozos haya terminado de incubar la coctelera, retire las normas y las muestras moviendo la placa en un contenedor de residuos.A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante. Lave la placa tres veces con 150 microlitros de solución de lavado añadiendo la solución de lavado y quitándola inmediatamente. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección sin etiquetar a cada pozo con el pipetter multicanal.Selle la placa e i incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM. Obtenga el anticuerpo secundario específico del refrigerador y colóquelo un hielo. Diluir el cuerpo secundario en solución diluyente de ensayo y mezclar suavemente.Para extraer el anticuerpo de detección libre sin etiquetar de la placa de 96 pozos, deslice el dedo hacia el contenedor de residuos y, a continuación, puntee la placa en una toalla de papel. Después de lavar la placa tres veces más descrito, agregue 25 microlitros de anticuerpo secundario a cada pozo con el pipeteador multicanal. Selle la placa e i incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM.Retire el anticuerpo secundario libre entrando en el contenedor de residuos y tocando la placa sobre una toalla de papel y luego lave la placa tres veces, como se describió anteriormente. A cada pozo de la placa, añada 150 microlitros de 1X Tris base Gold Read Buffer con tensioactivo, que contiene tripropilamina como coreactant para la generación de luz. Para evitar la producción de burbujas de aire, utilice técnicas de pipeteo inverso.Coloque la placa de 96 pocillos en la plataforma de la microplaca con el sistema de detección de electrochemilinoscencia. Con la cámara CCD integrada, comience inmediatamente a capturar datos. Recuentos de señales de registro que corresponden a unidades de luz relativas y son directamente proporcionales a la intensidad de la luz.Las curvas estándar MeCP2 se generaron a partir de MeCP2 humano en múltiples mediciones. El ECLIA puede cuantificar con precisión MeCP2 humano recombinante en un rango de un nanogrando por mililitro a 1800 nanogramos por mililitro. Utilizando ECLIA, los niveles de proteína MeCP2 se midieron en los licatos nucleares cerebrales a partir de ratones heterocigotos y hembras de tipo salvaje y de un ratón knockout MeCP2.ECLIA se llevó a cabo en lysates celulares desde un control saludable y desde la línea celular c. 806delG utilizada como modelo para el síndrome de Rett. No se detectó proteína MeCP2 en las líneas celulares mutadas por ECLIA o por inmunofluorescencia.ECLIA también se utilizó para investigar la captación de Tat-MeCP2 por la línea celular deficiente de MeCP2 horas extras. La precisión de ECLIA inter e intra ensayo se determinó durante tres días consecutivos. Para la futura terapia de reemplazo de proteínas, el parto con MeCP2 se puede optimizar repetidamente después de la evaluación del nivel de proteína por parte de ECLIA.

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