Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

Vi är mycket tacksamma mot dr Brigitte Sturm för hennes stöd med ECLIA-instrumentet.

Godkännande för hudbiopsi upphandling för forskningsändamål erhölls från Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australien. Samtycke till djurförsök erhölls från det österrikiska förbundsministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi, som utfördes i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
OBS: Principen om ECLIA-systemet finns i figur 1.
1. Antikroppsval</p...

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

För att mäta endogena MeCP2, rekombinanta MeCP2 och TAT-MeCP2 nivåer, en 96-väl plattan ECLIA utvecklades. Det har visat sig att förlust av MeCP2 protein funktion leder till RTT syndrom6, för vilka behandlingen är för närvarande begränsad till symptom förvaltning och sjukgymnastik. En lovande behandlingsaveny är den så kallade proteinersättningsterapin, där MeCP2-nivåer kan titreras upp till den nödvändiga koncentrationen12,,13...

Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) är baserad på en process som använder etiketter som är utformade för att avge luminescence när elektrokemiskt stimuleras. Det är en allmänt tillämplig teknik för kvantitativ påvisande av biologiska analyter inom basindustri och akademisk forskning, livsmedelsindustrin samt klinisk diagnostik1. Vanligen används en engångsplatta med 96-brunnsplatta med kolbläckelektroder. Dessa elektroder fungerar som en solid-fas bärare för immunoassay. En sekundär antikropp konjugeras till en elektroketuminescerande etikett och när elektricitet appliceras på systemet utlöses ljusemission av kemikalieetiketten. En extremt låg ljudladdningskopplad anordning (CCD) registrerar den ljusintensitet som är direkt proportionell mot det antigen som är bundet till avskiljningsantikroppen, vilket leder till kvantifiering av den riktade analyten av provet2. Jämfört med den enzymrelaterade immunosorbentanalysen (ELISA) anses ECLIA vara fördelaktigt eftersom det ger högre känslighet och reproducerbarhet samt bättre automatisering och konsekvens3.
Här analyserade vi metyl-CpG bindande protein 2 (MeCP2) nivåer i prover av mänskligt och murin ursprung samt olika varianter av rekombinanta proteinet med hjälp av det nyutvecklade ECLIA-systemet. MecP2 är ett X-linked nukleinsyrabindande protein som är känt för att interagera med metylerade DNA-sekvenser. Detta protein har varit inblandad i regleringen av genuttryck4,5. Förlust av funktion mutationer i genen som kodar detta protein är de största syndarna som orsakar Rett syndrom (RTT), en allvarlig neurodevelopmental disorder6. En annan MeCP2-relaterad sjukdom, MECP2 dubbelarbete syndrom, leder också till neurologiska symtom som kan överlappa med dem i RTT7. Särskilt kvinnor påverkas främst av RTT medan män är mest drabbade av MECP2 dubbelarbete syndrom6,7.
Dessa sjukdomar är associerade med otillräckliga eller överskott MeCP2 nivåer respektive i centrala nervsystemet (CNS). Därför skulle behandlingsalternativ för RTT som innebär att öka MeCP2-nivåerna i CNS måste undvika de skadliga effekterna i samband med överskott av MeCP27. På grund av detta faktum är en mycket känslig och exakt kvantifiering av MeCP2-proteinnivåer, i enlighet med ECLIA-systemet, avgörande för utvecklingen av forskning om RTT och MECP2 dubbelarbete. De exakta mätningarna av endogena och exogena MeCP2-nivåer från mänskliga cellinjer och musvävnadsprover samt ett rekombinant protein bestående av humant MeCP2 isoform B (även känd som isoform e1), och en minimal N-terminal HIV-TAT transduktionsdomän (TAT-MeCP2) som har potential att passera blod-hjärnbarriären8,9 presenteras i detta arbete.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

ECLIA är en mångsidig metod som kan kvantifiera endogena och rekombinanta proteinmängder i ett 96-brunnsformat. För att visa ECLIA effektivitet, denna analys användes för att analysera inneboende nivåer av MeCP2 i mus hjärnvävnad och upptag av TAT-MeCP2 i mänskliga dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA producerar mycket exakta och reproducerbara mätningar med lågt intra- och inter-assay-fel. Sammanfattningsvis utvecklade vi en kvantitativ metod för utvärdering av MeCP2 proteinvarianter som kan användas i skärmar med hög genomströmning.

Principen i ECLIA-systemet beskrivs i figur 1. Standardkurvor för två MeCP2-varianter visas i figur 2. Exakt kvantifiering var möjligt över ett brett spektrum av koncentrationer (1−1 800 ng/ml). I figur 3analyserades MeCP2 nivåer av lysates som härrör från mushjärna och HDFs. MeCP2 uttryck i hjärnan nukleära lysates från heterozygous, wildtype och knockout möss jämfördes i figur 3A, med...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) är en ny metod för kvantitativ detektion av endogena och exogent tillämpas MeCP2 protein varianter, som producerar mycket kvantitativa, exakta och reproducerbara mätningar med låg inom- och inter-assay fel över ett brett arbetsområde. Här beskrivs protokollet för MeCP2-ECLIA i ett 96-brunnsformat.

En elektrochemiluminescence-baserad analys för MeCP2 Protein Varianter

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA är en enkel men effektiv metod för att kvantifiera cellulära nivåer av MeCP2. ECLIA är snabb, känsligare och lättare att hantera jämfört med andra kvantifieringsmetoder som Western blot och ELISA. För att förbereda tvättlösningen, som är 0,5%Tween 20 i PBS, tillsätt 500 mikroliter av Tween 20 till en liter PBS och blanda kraftigt.Förbered en blockerande lösning på 3%Blocker A och PBS och rör om försiktigt. Sterilisera blockeringslösningen genom filtrering. För att förbereda assay spädningslösningen, 1%Blocker A, och PBS, tillsätt fem milliliter av blockerande lösning till 10 milliliter PBS.Nästa tina den monoklonala musen anti-MeCP2 antikropp på is. Blanda 0,67 mikroliter av antikroppen med fyra milliliter PBS, sedan vortexa lösningen. För att lösningslackera den 96-väl höga bindplåten, dispensera försiktigt 25 mikroliter av beläggningslösning i nedre hörnet av varje brunn, med hjälp av en flerkanalsrörare.Badda 96-brunnsplattan försiktigt på varje sida för att säkerställa att beläggningslösningen täcker botten av varje brunn. Täta plattan med självhäftande folie, och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Hämta 96-brunnsplattan från kylskåpet och ta ut folien.Avlägsna antikroppsbeläggningslösningen i brunnarna genom att snärta in den i en avfallsbehållare. Tryck sedan på plattan på en pappershandduk för att ta bort eventuell återstående lösning. Därefter lägger du till 125 mikroliter av blockerande lösning till varje brunn.Sedan försegla plattan igen med självhäftande folie. Placera plattan på en orbital mikroplattskaskare, inställd på 800 RPM, och inkubera den i 90 minuter vid rumstemperatur. Tina på is en injektionsflaska av MeCP2 eller Tat-MeCP2 protein stamlösning, mus hjärnan lysates, och HDF lysates.Späd protein stamlösningen i rena rör enligt beskrivningen i tabell två av manuskriptet. Nästa späda ut lysateproverna. För musen hjärnan lysates, använd en till 20 mikrogram per 25 mikroliter av lys buffert.För HDF-lysate, lägg till 0,25 till ett mikrogram per 25 mikroliter av lysbuffert. Efter att 96-brunnsplattan har inkuberat i 90 minuter, avlägsna blockeringslösningen från brunnarna genom att snärta in den i en avfallsbehållare. Tryck sedan på plattan på en pappershandduk för att ta bort eventuell återstående lösning.Tvätta sedan plattan tre gånger med 150 mikroliter av tvättlösning, genom att lägga till tvättlösningen och omedelbart ta bort den. Lägg till 25 mikroliter av standarder och prover till brunnarna på 96-brunnsplattan. Täta plattan och inkubera den i ytterligare fyra timmar vid rumstemperatur med konstant 800 RPM-skakning.Tina den omärkta detektionsantikroppen, polyklonal kanin anti-MeCP2, på is. Med hjälp av analys späd spädningsvätska lösning, antikroppen vid ett förhållande av ett till 6, 000. När 96-brunnsplattan är färdig med att ruva på skakmaskinen, ta bort standarderna och proverna genom att snärta fast plattan i en avfallsbehållare.Tryck sedan på plattan på en pappershandduk för att ta bort eventuell återstående lösning. Tvätta plattan tre gånger med 150 mikroliter tvättlösning genom att tillsätta tvättlösningen och omedelbart ta bort den. Lägg till 25 mikroliter av omärkt detektionsantikroppslösning till varje brunn med flerkanalspipettern.Täta plattan och inkubera den i en timme vid rumstemperatur med konstant skakning vid 800 RPM. Erhåll den specifika sekundära antikroppen från kylskåpet och placera den en is. Späd den sekundära kroppen i assay spädningsvätska lösning och blanda försiktigt.För att ta bort den fria omärkta detektionsantikroppen från 96-brunnsplattan, snärta in i avfallsbehållaren och knacka sedan på tallriken på en pappershandduk. Efter tvättning av plattan tre gånger som perviously beskrivs, tillsätt 25 mikroliter av sekundära antikropp till varje brunn med multichannel pipetter. Täta plattan och inkubera den i en timme vid rumstemperatur med konstant skakning vid 800 RPM.Ta bort den fria sekundära antikroppen genom att snärta in i avfallsbehållaren och knacka på plattan på en pappershandduk och tvätta sedan plattan tre gånger, som tidigare beskrivits. Till varje brunn av plattan, tillsätt 150 mikroliter av 1X Tris bas Gold Läs buffert med ytaktivt, som innehåller tripropylamin som ett coreaktmedel för ljusgenerering. För att undvika att producera luftbubblor, använd omvända pipetttekniker.Placera 96-brunnsplattan på mikroplattplattformen med detekteringssystem för elektrokemiluminescens. Använda den inbyggda CCD-kameran, omedelbart börja fånga data. Registrera signalantal som motsvarar relativa ljusenheter och är direkt proportionella mot ljusets intensitet.MeCP2 standard kurvor genererades från mänskliga MeCP2 i flera mätningar. ECLIA kan exakt kvantifiera rekombinanta mänskliga MeCP2 över ett intervall från ett nanogram per milliliter till 1800 nanogram per milliliter. Med hjälp av ECLIA mättes MeCP2-proteinnivåerna i hjärn nuclear lysates från heterozygous och kvinnliga vilda möss och från en MeCP2 knockout mus.ECLIA genomfördes på cell lysates från en hälsosam kontroll och från c. 806delG cellinje som används som modell för Rett syndrom. Ingen MeCP2 protein upptäcktes i mutanta cellinjerna av ECLIA eller av immunofluorescens.ECLIA användes också för att undersöka upptaget av Tat-MeCP2 av MeCP2 bristfälliga cellinje övertid. ECLIA inter och intra assay precision fastställdes under tre på varandra följande dagar. För framtida proteinersättningsterapi kan MeCP2-leverans upprepade gånger optimeras efter proteinnivåbedömning av ECLIA.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjärnmembranfraktioner: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tillvägagångssätt för att utvärdera lokalisering av subsynaptisk protein

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

En Fluorogenic peptid klyvning analysen till skärmen för den proteolytiska aktiviteten: program för coronavirus spike protein aktivering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Ett integrerat arbetsflöde för identifiering och kvantifiering på FDR-kontrollbaserat oriktat metabolom

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...