Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

Eclia aletine verdiği destekten dolayı Dr. Brigitte Sturm'a çok müteşekkiriz.

Araştırma amaçlı cilt biyopsisi alımı için onay Westmead, Avustralya Çocuk Hastanesi İnsan Araştırma Etik Komitesi'nden alındı. Hayvan deneyleri için onay, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilen Avusturya Federal Bilim, Araştırma ve Ekonomi Bakanlığı'ndan alındı (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOT: ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Antikor seçimi
<ol><li>Çeş...

<ol>
	<li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+applications+of+ECL.">Clinical and biological applications of ECL.</a> Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).</li><li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads.">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li><li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies.">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li><li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2+mutations:+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome.">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).</li><li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeCP2,+a+key+contributor+to+neurological+disease,+activates+and+represses+transcription.">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li><li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+a+complex+disorder+with+simple+roots.">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li><li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+Syndrome:+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation.">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li><li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants.">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).</li><li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).</li><li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells.">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li><li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAP:+A+two+minute+cell+fractionation+method.">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294 (2010).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors.">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells:+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration.">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li><li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder.">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li><li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MECP2+Duplication+Syndrome.">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir6, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon12kadar titrated olabilir12 ,13,<s...

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı1biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon vetutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.
Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X'e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır6. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar7. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu6,,7etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.
Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP27aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT'nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B 'den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada8,sunulmuştur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2'nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.

ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'deaçıklanmıştır. İki MeCP2 varyantı için standart eğriler Şekil 2'degösterilmiştir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda (1−1.800 ng/mL) doğru niceleme mümkün oldu. Şekil 3'tefare beyni ve HDF'lerden elde edilen LYSAt'ların MeCP2 düzeyleri analiz edildi. Beyinde mecp2 ekspresyonu heterozigot, yabani tip ve nakavt farelerden karşılaştırıldı, Şekil</strong...

Watch this Scientific Journal Video about An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants at JoVE.com

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA, MeCP2'nin hücresel seviyelerini ölçmek için basit ama etkili bir yöntemdir. ECLIA hızlı, daha duyarlı ve Batı leke ve ELISA gibi diğer nicelik yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha kolay işlenir. PBS'de %0,5 Ara 20 olan yıkama çözeltisini hazırlamak için 500 mikrolitre Tween 20 ila bir litre PBS ekleyin ve şiddetle karıştırın.%3 Bloker A ve PBS'lik bir engelleme çözeltisi hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Filtrasyon çözeltisini sterilize edin. Tazyikli dilüent çözeltisi , %1 Bloker A ve PBS'yi hazırlamak için, 10 mililitre PBS'ye beş mililitre engelleme çözeltisi ekleyin.Sonra buz üzerinde monoklonal fare anti-MeCP2 antikor eritin. PBS dört mililitre ile antikor 0.67 mikrolitre karıştırın, sonra çözelti girdap. 96 kuyulu yüksek bağlama plakasını solüsyon kaplamak için, çok kanallı bir pipet terazisi kullanarak her kuyunun alt köşesine 25 mikrolitre kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın.Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için 96 kuyulu plakayı her iki tarafa da hafifçe dab. Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Buzdolabından 96 kuyulu tabağı alın ve folyoçıkarın.Bir atık kabına flicking tarafından kuyularda antikor kaplama çözeltisi çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Ardından, her kuyuya 125 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin.Sonra tekrar yapışkan folyo ile plaka mühür. Plakayı 800 RPM olarak ayarlanan yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın. MeCP2 veya Tat-MeCP2 protein stok çözeltisi, fare beyin lysates ve HDF lysates buz bir şişe üzerinde çözülme.El yazmasının ikinci tablosunda açıklandığı gibi protein stok çözeltisini temiz tüplerde seyreltin. Daha sonra lysate örneklerini seyreltin. Fare nin beyin lysates için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 1 ila 20 mikrogram kullanın.HDF lysate için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 0,25 ila bir mikrogram ekleyin. 96 kuyulu plaka 90 dakika kuluçkaya yattıktan sonra, bir atık kabına hareket ettirerek blokaj çözeltisini kuyulardan çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.Daha sonra yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak, 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile plakayı üç kez yıkayın. 96 kuyulu plakanın kuyularına 25 mikrolitre standart ve numune ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında sabit 800 RPM sallayarak dört saat daha kuluçkaya yatırın.Etiketsiz algılama antikorunu, çok klonal tavşan anti-MeCP2'yi buz üzerinde eritin. Titreme dilüent çözeltisi kullanarak antikoru 1 ile 6,000 arasında seyreltin. 96 kuyulu plaka shaker üzerinde kuluçka bittiğinde, bir atık konteyner içine plaka flicking tarafından standartları ve örnekleri kaldırın.Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak tabağı 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın. Çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre etiketsiz algılama antikor çözeltisi ekleyin.Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın. Buzdolabından belirli ikincil antikor alın ve bir buz yerleştirin. İkincil gövdeyi istinat dilüent çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.96 kuyulu plakadan ücretsiz etiketsiz algılama antikorlarını çıkarmak için, atık kabın içine dinleyip plakaya kağıt havluya dokunun. Plakayı üç kez yıkadıktan sonra, çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın.Atık kabın içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunarak serbest ikincil antikor çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi, üç kez plaka yıkayın. Plakanın her kuyusuna, 1X Tris baz Altın Okuma Tampon'una 150 mikrolitre ekleyip, ışık üretimi için bir eşregülan olarak tripropilamin içeren sürfaktanlı bufferı ekleyin. Hava kabarcıkları üreten önlemek için, ters pipetleme teknikleri kullanın.Elektrokemilüminesans algılama sistemi ile mikroplaka platformu üzerinde 96-iyi plaka yerleştirin. Dahili CCD kamerayı kullanarak, hemen veri yakalamaya başlayın. Göreceli ışık birimlerine karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan kayıt sinyali sayıları.MeCP2 standart eğrileri birden fazla ölçümde insan MeCP2'den üretildi. ECLIA, rekombinant insan MeCP2'yi mililitre başına bir nanogramile mililitre de 1800 nanogram arasında doğru bir şekilde ölçebilir. ECLIA kullanılarak, MeCP2 protein düzeyleri heterozigot ve dişi yabani farelerden ve bir MeCP2 nakavt faresinden beyin nükleer lysates ölçüldü.ECLIA, sağlıklı bir kontrolden hücre lysates ve Rett sendromu için model olarak kullanılan c. 806delG hücre hattından yapılmıştır. Mutant hücre hatlarında ECLIA veya immünororesans ile MeCP2 proteini saptırılmadı.ECLIA ayrıca MeCP2 eksik hücre hattı fazla mesai tarafından Tat-MeCP2 alımını araştırmak için kullanılmıştır. ECLIA inter ve intra tsay hassasiyeti üç gün üst üste belirlendi. Gelecekteki protein replasman tedavisi için, MeCP2 doğumu ECLIA tarafından protein düzeyi değerlendirmesinden sonra tekrar tekrar optimize edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...