Name: setup of capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry (ce-icp-ms) for quantification of iron redox species (fe(ii), fe(iii))
Uploaded: 2020-05-04T14:00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII at JoVE.com

VV была поддержана интрамуральным исследовательским грантом (Forschungsf'rderung) Университетского медицинского центра Гёттингена и исследовательской программой Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung.

<ol>
	<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+early-life+iron+exposure+critical+in+neurodegeneration.">Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).</li><li>Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aging+of+Iron+Man.">The Aging of Iron Man.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).</li><li>Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurological+effects+of+iron+supplementation+in+infancy:+finding+the+balance+between+health+and+harm+in+iron-replete+infants.">Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants.</a> Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).</li><li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+cancer:+more+ore+to+be+mined.">Iron and cancer: more ore to be mined.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li><li>Kehrer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Haber-Weiss+reaction+and+mechanisms+of+toxicity.">The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity.</a> Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).</li><li>Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxidation+in+cell+death.">Lipid peroxidation in cell death.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).</li><li>Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JEM+Spotlight:+Metal+speciation+related+to+neurotoxicity+in+humans.">JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans.</a> Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).</li><li>Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+speciation+of+iron,+manganese,+and+copper+in+cerebrospinal+fluid+by+strong+cation+exchange+chromatography+-+sector+field+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).</li><li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+excess+iron+on+oxidative+stress+and+gluconeogenesis+through+hepcidin+during+mitochondrial+dysfunction.">Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction.</a> Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).</li><li>Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferroptosis:+an+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death.">Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).</li><li>Stockwell, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferroptosis:+A+Regulated+Cell+Death+Nexus+Linking+Metabolism,+Redox+Biology,+and+Disease.">Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease.</a> Cell. 171 (2), 273-285 (2017).</li><li>Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+speciation+in+human+cerebrospinal+fluid+using+CZE+coupled+to+inductively+coupled+plasma+MS.">Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS.</a> Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).</li><li>Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+leads+to+an+increase+in+markers+of+oxidative+stress+as+well+as+to+a+shift+in+the+ratio+of+Fe(II)/(III)+in+rat+brain+tissue.">Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue.</a> Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).</li><li>Neth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , (2015).</li><li>Neth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Brain+Metallome/Metabolome+Pattern+due+to+a+Single+i.v.+Injection+of+Manganese+in+Rats.">Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats.</a> Plos One. 10 (9), (2015).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+causes+neurotoxic+iron+accumulation+via+translational+repression+of+Amyloid+Precursor+Protein+(APP)+and+H-Ferritin.">Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin.</a> Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).</li><li>Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+fractionation+in+a+case-control+study+concerning+Parkinson's+disease:+Cu-amino+acids+discriminate+CSF+of+PD+from+controls.">Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).</li><li>Thibault, P., Dovichi, N. J., Camilleri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+instrumentation+and+detection+systems+including+mass+spectrometry.">General instrumentation and detection systems including mass spectrometry.</a> Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. , 23-89 (1998).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paravascular+Pathway+Facilitates+CSF+Flow+Through+the+Brain+Parenchyma+and+the+Clearance+of+Interstitial+Solutes,+Including+Amyloid+beta.">A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li><li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+speciation+using+capillary+electrophoresis-ICP-mass+spectrometry.">Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).</li><li>Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Capillary electrophoresis: Principles and practice. , (1993).</li><li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoretic+methods+for+a+clear+identification+of+selenoamino+acids+in+complex+matrices+such+as+human+milk.">Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk.</a> Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).</li><li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4.">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).</li><li>Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Line+Selectivity+Improves+the+Predictive+Power+of+Pharmacogenomic+Analyses+and+Helps+Identify+NADPH+as+Biomarker+for+Ferroptosis+Sensitivity.">Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity.</a> Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Так как железо играет заметную роль в прогрессировании ОС, тем самым облегчая митохондриальную дисфункцию или FTP, универсальный количественный метод на основе CE-ICP-MS для одновременного fe (II)/Fe (III) видообразования представлен в этой статье, и его применение образцово продемонстрировано в лизированиях клеток. Метод при условии короткого времени анализа и цифры заслуг (ЛОЗ, точность, восстановление) подходят для образцов, имеющих отношение к спецификации редокс железа конкретно в нейродегенеративных и онкологических исследований. По сравнению с предыдущими методами, основанными на LC, этот метод на основе CE практически не зависит от пакетов столбца и ранее наблюдались проблемы воспроизводимости после изменения LC-столбца. Капиллярная подготовка перед каждым запуском составляет 4 минуты и время анализа на образец с умеренной соленостью до 3 мин. Помимо заряда и размера молекулы, время миграции в СЗЕ зависит от проводимости в пробной пробке, что приводит к изменению времени миграции или сдвигам, когда сами образцы оказывают значительное влияние на проводимость. Такие сдвиги во времени миграции хорошо известны в капиллярных электрофорез. Это проблема, известная из литературы21,22. Стандарты и лизаты клеток SH-SY5Y имели умеренную и однородную проводимость. Следовательно, время миграции показало лишь небольшое изменение с хорошей точностью. Однако для образцов с высокой проводимостью продолжительное время миграции может наблюдаться до 5 минут. Поэтому для четкой идентификации видов рекомендуются стандартные дополнения.
Критическим вопросом в спецификации красного железа является стабильность видов (т.е. поддержание Fe (II)/(III) эквилибрии) во времяподготовки образца 8,13. Неуместные рН или хелатирующие химические вещества, а также ненадлежащие условия хранения, такие как кислород (воздух) при контакте с образцом или разрыв в глубоко замороженном хранилище, могут легко изменить баланс Fe (II)/(III). Поэтому для подготовки лизатов клеток SH-SY5Y для этих образцов был выбран лизизный буфер без каких-либо хелатирующих химических веществ, физиологических рН, но инертная накладка газа при подготовке образца, в пробных контейнерах и немедленной глубокой заморозке.
В литературе можно найти полуколиченые подходы к мониторингу Fe (II). Для улучшения понимания роли железа в окислительном стрессе несколько исследовательских групп разработали специальные зонды Fe(II) для полуколичественного мониторинга и визуализации аномальной высоты железа в пробирке. Однако, важно отметить, такие зонды не считают Fe (III) и не количественно, но доклад просто "больше" или "менее" Fe (II)). На сегодняшний день, только несколько биомаркеров доступны для определения ОС и FPT, будучи из-за отсутствия надежных методов для одновременной количественной оценки Fe (II)/Fe (III) redoxвидов 23,24. Имея это в виду, представленный метод - содействие быстрой количественной оценки как Fe (III) и Fe (II) в одном запуске - может стать перспективным инструментом для углубления понимания железозависимых молекулярных процессов.

Сегодня наиболее очевидно, что железо-опосредованное окислительное напряжение (ОС) играет решающую роль в многочисленныхрасстройств,в частности, в нейродегенеративных расстройств мозга, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, атакже в рак 1,2,3,4. ОС тесно связана с состоянием и балансом редокс-пары Fe (II)/Fe (III). В то время как Fe (III) является redox-неактивным, Fe (II) мощно генерирует реактивный вид кислорода (ROS) путем катализации H2O2 разложения следуют из гидроксилового радикала производства и мембраны перекисногоокисления липидов 5,6. На молекулярном уровне, Fe (II)-генерируемых ROS и пероксидированных фосфолипидов являются сильным нападением на целостность белков, липидов иДНК 7,8. Такая вредопроизвольная клеточная дисфункция была продемонстрирована, чтобы вызвать митохондриальнуюдисфункцию с уменьшенным содержанием АТФ 9 и может даже вызвать запрограммированную смерть некротических клеток, известный какферроптоз(FPT) 10,11. Таким образом, количественное Фе (II)/(III) видообразование редокса имеет большое значение в широком спектре расстройств, связанных с редоксом.
Химическая спецификация является устоявшимся инструментом для изучения микроэлементов биологическойроли и обмена веществ в целом 7,8, а также внейродегенеративных состояниях 12,,13,,14,,15,,16,,17., Методы видообразования Фе-редокса, найденные в литературе, как правило, основаны на разделении жидкой хроматографии (LC). Некоторые литературы используют индуктивно соединенную плазменную масс-спектрометрию (ICP-MS) в качестве элемента селективного детектора. Однако, в обычной работе LC, чрезмерное время чистки было необходимо между бегами. Еще более проблематичным является то, что пакетная вариация столбцов LC заставила пере оптимизацию условий elution после каждого изменения столбца. Эти проблемы препятствуют высокой пропускной способности. Требуется дополнительное время, чтобы получить приемлемую надежность и тщательно оценить метод еще раз.
Чтобы обойти эти недостатки, метод представлен здесь для Fe (II)/Fe (III) redox speciation на основе капиллярного электрофореза индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии (CE-ICP-MS). CE предлагает различные преимущества по сравнению с LC18. Капилляры не имеют стационарной фазы и, таким образом, зависят (почти) не от личности партии. Когда они в возрасте или заблокированы, они быстро заменяются, показывая, как правило, неизменную производительность. Шаги очистки и очистки между образцами являются эффективными и короткими, и время анализа на выборку тоже короткое.
Представленный метод надежен с хорошими цифрами заслуг. В качестве доказательства принципа, метод применяется к человеку дофаминергической нейробластомы (SH-SY5Y) клеток ликат, образец типа важно в нейродегенерации, а также исследованиярака 19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CE capillary</td>
			<td>CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany</td>
			<td>105180-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE system</td>
			<td>PrinCe technolgies</td>
			<td>0005.263</td>
			<td>model PrinCe 760</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Superclear Tubes 15 ml</td>
			<td>Analytics-shop.com by Altmann Analytik</td>
			<td>PEN0777704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Superclear Tubes 50 ml</td>
			<td>Analytics-shop.com by Altmann Analytik</td>
			<td>PEN0777694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2 * 4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>803945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidflex Silikon HG-Schlauch</td>
			<td>ProLiquid</td>
			<td>4001106HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary OD 360 &#181;m, ID 50 &#181;m</td>
			<td>Chromatographie Service GmbH</td>
			<td>105180-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid, 1 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101652500</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP-MS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N814003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, 3-way female</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7318229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, cone male</td>
			<td>neoLab Migge</td>
			<td>2-1895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, male</td>
			<td>neoLab Migge</td>
			<td>2-1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peakfit peak evaluation software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>PeakFit 4.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wire</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0737.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tube</td>
			<td>ProLiquid</td>
			<td>6000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab156034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammoniumhydroxide, 25 %</td>
			<td>Merck</td>
			<td>814748</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON-tube R-3607</td>
			<td>ProLiquid</td>
			<td>3700203A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setup of capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry (ce-icp-ms) for quantification of iron redox species (fe(ii), fe(iii))

Дисгеостаз метаболизма железа учитывается в патофизиологических рамках многочисленных заболеваний, в том числе онкологических и нескольких нейродегенеративных состояний. Чрезмерное железо приводит к свободному редокс-активному Fe (II) и может вызвать разрушительные последствия в клетке, такие как окислительный стресс (ОС) и смерть от перекисного окисления липидов, известного как ферроптоз (FPT). Таким образом, количественные измерения железа ферроса (Fe(II)) и железа феррика (Fe(III)) вместо полного определения Fe является ключом к более внимательному пониманию этих пагубных процессов. Поскольку определения Fe (II)/(III) могут быть затруднены быстрыми сдвигами редокс-состояния и низкими концентрациями в соответствующих образцах, таких как спинномозговая жидкость (CSF), должны быть доступны методы, которые быстро анализируют и обеспечивают низкие пределы количественной оценки (ЛОЗ). Капиллярный электрофорез (CE) предлагает преимущество быстрого разделения Fe (II)/Fe(III) и работает без стационарной фазы, которая может помешать балансу редокса или вызвать прилипание аналита. CE в сочетании с индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрией (ICP-MS) в качестве детектора предлагает дальнейшее улучшение чувствительности и избирательности обнаружения. Представленный метод использует 20 мМВ HCl в качестве фонового электролита и напряжения 25 кВ. Пиковые формы и пределы обнаружения концентрации улучшаются путем укладки проводимости рН. Для уменьшения на 56«ArO» ICP-MS работал в режиме динамической реакционной ячейки (ДРК) с NH+3 в качестве реакционной реакции газа. Метод достигает предела обнаружения (LOD) в 3 мкг/л. Благодаря укладке, более высокие объемы инъекций были возможны без затруднения разделения, но улучшения LOD. Калибровки, связанные с пиковой областью, были линейными до 150 мкг/л. Точность измерений составила 2,2% (Fe(III)) до 3,5% (Fe(II)). Точность времени миграции составила lt;3% для обоих видов, определяемых в 1:2 разбавленных лизатах клеток нейробластомы человека (SH-SY5Y). Эксперименты по восстановлению со стандартным добавлением показали точность 97% Fe (III) и 105% Fe (II). В реальных био-образцах, таких как CSF, время миграции может варьироваться в зависимости от различной проводимости (т.е. солености). Таким образом, пик идентификации подтверждается стандартным добавлением.

Измерения стандартов и калибровки Время миграции было выяснено с помощью одно стандартных инъекций: стандарт Fe (III) отслеживался на уровне 118 с времени миграции и стандарт Fe (II) в 136 с времени миграции. Пределы обнаружения были рассчитаны с использованием критерия 3 "со ссылкой на базовый шум, и стандартная концентрация 50 мкг/л.LOD (Fe(II) составила 3,1 мкг/ли LOD (Fe(III) составила 3,2 мкг/л. Пиковая калибровка для обоих видов железа была линейной от LOD до 150 мкг/л. В то время как линейность Fe (III) была доказана также для более высокой концентрации, наклон кривой калибровки для Fe (II) уменьшился. Верхний предел концентрации в 150 мкг/л был сочтен достаточным, поскольку био-образцы, имеющие отношение к определению Fe (II)/(III), как правило, имеют более низкую концентрацию Fe. В случае более высокой концентрации образцы могут быть разбавлены соответствующим образом. Калибровка пиковой высоты была проверена до 600 мкг/л и показала линейность по всему испытанного диапазону. Это показано на рисунке 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Кривые калибровки (пиковая высота) Fe (III) и Fe (II). Пик высоты, связанных калибровки обоих видов Fe redox являются линейными со склоном около 161 "X Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Анализ лисяя клеток SH-SY5Y Анализ лисата клеток SH-SY5Y показал несколько более медленный миграцию видов редокса железа из-за несколько более высокой проводимости. Fe (III) отслеживался в 124 с миграционного времени, Fe (II) в 158 с миграционного времени. Точность времени миграции в ликате ячейки SH-SY5Y составила 2% для Fe (III) и 3% для Fe (II). Количественные измерения Fe (II) и Fe (III) с использованием этого метода показали концентрацию Fe (III) концентрации 330 мкг/л и fe (II) концентрации 84 мкг/л, что привело к соотношению Fe(II)/Fe (III) 0,25. Соответствующая 56 Фе-селективнаяэлектроферограмма продемонстрирована на рисунке 3.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2.jpg"> Рисунок 3: 56Fe-специфической электроферограммы SH-SY5Y ячейки лисации. Fe (III) контролируется на 123 с достижения 58025 CPS пик высоты, будучи четко отделены от Fe (II) на 158 с, достигнув 22800 CPS Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII at JoVE.com

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Этот метод видообразования редокса железа основан на капиллярной электрофорез-индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии с укладкой образца в сочетании с коротким анализом за один запуск. Метод быстро анализирует и обеспечивает низкие пределы количественной оценки для видов красного железа в различных тканях и биофлюидных образцах.

Установка капиллярной электрофорезной индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии (CE-ICP-MS) для количественной оценки видов железного редокса (Fe (II), Fe (III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Чрезмерное железо приводит к свободному редокс-активного железа два с лишним, которые могут вызвать разрушительные последствия в клетке, такие как окислительный стресс и гибель клеток от перекисного окисления липидов известный как ферроптоз. Количественные измерения железа ферросуса и железа являются ключом к более внимательному пониманию этих пагубных процессов. Этот метод CE-ICP-Ms обеспечивает как быстрый анализ, так и низкие пределы количественной оценки, которые необходимы для количественной оценки видов железо-редокса.Начните с выбора небулайзера с низким объемом самооспирации и подготовки соответствующих частей для установки домашнего интерфейса. Подключите два трехмерных женских сочных разъема с мужским конусом, подключив левый конец нижней полосы люэра к мужскому разъему и мужской разъем к среднему соединению верхнего трехголевого люэра. Затем поместите одну сантиметровую трубку над платиновой проволокой и используйте одну сантиметровую силиконовую трубку для подключения первой трубки и сопла мужского более люэрного разъема.Зафиксив сборку к среднему соединению нижнего трехоборотного люэр-разъема путем вращения винта. Нажмите одну сантиметровую трубку над выходом капилляра CE и положение на восемь-девять сантиметров от конца, а затем подключить его к сопла мужской соляной разъем с силиконовой трубки. Положите всю сборку через бар верхнего трехоборотного разъема T и исправить мужской разъем люэра и левый конец женского трехоборотного люэра разъем винт вращения.Затем зафиксировать 25-сантиметровую силиконовую трубку на сопле мужского люэра и зафиксировать всю сборку в нижней части бара от нижнего трехмерного разъема приманки. Плотно нажмите один сантиметр силиконовой трубки, пять миллиметров над концом небулайзера. В то время как второй мужской конус конус разъем подключен к выступающей части трубки.Переместите часть интерфейса с выступающим ce капилляром к мужскому конусу на небулайзере, затем аккуратно вставьте капилляр через мужской конус и более широкую часть капилляра небулайзера. При необходимости отрегулируйте длину выступающего капилляра, отвинтив левую мужскую люэр, переверев люер с прикрепленными трубками в нужное положение и переустановив его. Верхние женские трехмерные сочные разъемы должны плотно прилегать к мужскому конусу.По его завершения с установкой приступить к МСП-г-жа Кривые калибровки были созданы для железа три и железа двух видов redox. Пределы обнаружения составили 3,1 микрограмма на литр железа 2 и 3,2 микрограмма на литр для железа три и линейность была продемонстрирована до 150 микрограмм на литр.Анализ SH-SY5Y Cell Lysate показал несколько более медленный миграцию видов редокса железа из-за несколько более высокой проводимости. Измеренные концентрации железа 3 и железа два составили 330 микрограмм на литр и 84 микрограмма на литр, соответственно. В результате железа два к трем соотношение 0,25.Наиболее важным шагом этого протокола является тщательная вставка выступающей капиллярной CE через установленный интерфейс и его подходящее позиционирование, связанное с капилляром небулайзера. Представленные здесь методы могут стать перспективным инструментом углубления понимания железозависимых молекулярных процессов. Тщательно разработанные исследования необходимы для проверки, если железо два с лишним, железо три с лишним количественной оценки может служить в качестве потенциального биомаркера для выявления тканей, риску железа опосредованного смертельного повреждения в контексте нейродегенеративных и онкологических заболеваний.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid Высокая пропускная способность Виды Идентификация ботанического материала с использованием прямого анализа в реальном времени с высоким разрешением масс-спектрометрии

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-мно Assay для количественного определения белков клетки хозяина в области биофармацевтики белка по жидкостной хроматографии ионной подвижности QTOF масс-спектрометрии

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Practical Guide on Coupling a Scanning Mobility Sizer and Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (SMPS-ICPMS)

A Practical Guide on Coupling a Scanning Mobility Sizer and Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer SMPS-ICPMS

Практическое руководство по соединению сканирующего мобильщика и масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой (SMPS-ICPMS)

A large variety of analytical methods are available to characterize particles in aerosols and suspensions. The choice of the appropriate technique depends ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Анализ реального времени дыхание с помощью вторичных Nanoelectrospray ионизации в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Крупномасштабные протеомики сверху вниз с использованием зоне капиллярного электрофореза тандем масс-спектрометрия

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Высок объём и всеобъемлющей наркотиков наблюдения с помощью масс-спектрометрии многосегментные инъекций капиллярного электрофореза

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Интегрированная платформа манипулирования ячейками в сочетании с однозондом для анализа масс-спектрометрии наркотиков и метаболитов в односуспевающих клетках

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды