Name: immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Agradecemos p. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por anticorpos e A. Debec, os centros de ações bloomington e viena para moscas. Obrigado a C. Jackson por sugestões e discussões estimulantes.

1. Coleção de testículos de Drosophila
NOTA: Machos jovens (0-15 h pós-eclosão) são necessários para examinar células germinativas diploides (ou seja, espermatogonia e espermatocitocitos).
<ol><li>Selecione moscas jovens o máximo possível para minimizar a interferência do desenvolvimento de espermatóides.</li>
	<li>Anesthetize voa por breve exposição ao dióxido de carbono e transferência para uma plataformade moscas 14,15</...

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Este protocolo fornece um método para o bem sucedido imunolabeling de testículos de Drosophila adultos de montagem inteira. Conforme relatado em outros procedimentos, devem ser utilizados os machos jovens (até encurtamos a idade para menos de 20 horas após a eclosão) para minimizar a presença de espermatozoides em desenvolvimento, o que corre o risco de obstruir os espermatocitos. A dissecção deve ser rápida e a diluição do anticorpo deve ser ajustada para otimizar a relação sinal-ruído21,...

Os testículos de drosophila são um modelo valioso para o estudo da arquitetura nuclear. Em células espermatogoniais mitóticas, o volume nuclear é em grande parte ocupado por cromatina. Essas células passam por quatro rodadas de divisão, produzindo um cisto de 16 espermatos primários. Nos dias seguintes, os espermatocitos passam por 6 estágios de desenvolvimento (S1-S6), aumentando consideravelmente em volume, aproximadamente 20vezes 1,2. Eles também mudam sua morfologia nuclear. O contorno do núcleo, revelado pelo lamin Dm0, torna-se irregular e mostra profundas invaginações1,3. Isso é acompanhado por extensas alterações de expressão genética e modificações na organização cromatina1,4,5,6,7. Os cromossomos interfásicos são bem definidos no estágio S4-S5, formando três massas distintas correspondentes aos 2 principais autossomos bivalentes e o par X-Y ancorado com o nucleolus.
Mad1 foi originalmente isolado como um componente-chave do ponto de verificação mitótico (revisado em8). Na interfase, é descrito como localizado principalmente no envelope nuclear, mas também no nucleoplasma9,10,11. Em Drosophila testis, relatamos que Mad1 é proeminente no nucleoplasma, intimamente associado com as duas principais massas de cromatina autossômica e em menor grau com a cromatina XY. Definimos esta estrutura associada à cromatina como MINT (Território IntraNuclear contendo Mad1)12. Quatro outras proteínas foram associadas com MINTs em espermatotos: o nucleoporina Mtor/Tpr, o SUMO peptidase Ulp1, a proteína de checkpoint mitotístico Mad2 e uma subunidade de um complexo de Policomb Raf212.
Para completar a descrição dos MINTs, precisávamos usar anticorpos e fomos confrontados com os problemas técnicos geralmente encontrados com imunostendências em testículas: uma má permeabilidade resultando em uma significativa não uniformidade da coloração na profundidade dos testítes, particularmente nos grandes espermatocitos. Aspreparações anuladas aumentaram o acesso a anticorpos, mas levaram a imagens compactadas, restringindo as análises 3D e impedindo a medição da fluorescência quantitativa, incluindo a colocalização. O problema da penetração de anticorpos também poderia ser resolvido por agentes permeabilizadores como 0,3% Na desoxicolato13,mas este procedimento não resultou em nossas mãos resultados reprodutíveis. Como realizamos muitos experimentos de co-rotulagem, procuramos melhorar o protocolo de permeabilização. A combinação de 1% NP40 mais heptano resultou em mais reprodutibilidade, particularmente no estudo dos grandes espermatos.
Este protocolo realiza a fixação e a imunostenção de testículos na suspensão, melhorando a qualidade da amostra, bem como melhorando a reprodutibilidade, e tornando-a adequada para microscopia confocal. Usamos o protocolo para definir melhor as relações espaciais de certas proteínas de envelope nuclear com as estruturas nucleoplasmáticas de grandes espermatotos. Esse método permitirá melhores investigações das mudanças que acompanham o desenvolvimento de espermatotocitos, como por exemplo as dinâmicas mudanças estruturais do núcleo, incluindo cromatina, nucleoplasma e os poros nucleares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

Os testículos de drosophila são um poderoso sistema modelo para estudar processos biológicos, incluindo biologia de células-tronco, arquitetura nuclear, meiose e desenvolvimento de espermatozoides. No entanto, a imunolabelação de todo o teste de Drosophila é frequentemente associada com significativa não uniformidade da coloração devido à penetração de anticorpos. As preparações esmagadas só superam parcialmente o problema, pois diminui a qualidade 3D das análises. Aqui, descrevemos um protocolo de montagem inteira usando NP40 e heptano durante a fixação, juntamente com a imunolabelagem em mídia líquida. Preserva o volume adequado para microscopia confocal juntamente com rotulagem reprodutível e confiável. Mostramos diferentes exemplos de reconstituição 3D de núcleos espermatocitocitos de seções confocal. A reprodutibilidade intra e inter-testes permite quantificação 3D e comparação da fluorescência entre células únicas de diferentes genótipos. Utilizamos diferentes componentes da estrutura de MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1), bem como dois componentes associados ao complexo de poros nucleares para ilustrar este protocolo e suas aplicações nas maiores células dos testis, os espermatozoides S4-S5.

O principal obstáculo para a obtenção de uma coloração adequada dos testículos de Drosophila é a penetrabilidade limitada dos anticorpos, que foi parcialmente resolvida por meio de preparações esmagadas, mas ao custo de induzir uma restrição das análises 3D (por exemplo, representação 3D ou medida de colocalização). O procedimento permite rotulagem uniforme e preserva o volume de todas as células do testis. Aqui focamos a ilustração do método na representação 3D dos espermatos S4-S5, pois são as ma...

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

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Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...