Name: immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Antikorlar için P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura ve sinekler için A. Debec, Bloomington ve Viyana stok merkezlerine teşekkür ederiz. Öneriler ve teşvik edici tartışmalar için C. Jackson'a teşekkürler.

1. Drosophila testis koleksiyonu
NOT: Genç erkekler (eklozyon sonrası 0-15 saat) diploid mikrop hücrelerini (spermatogonia ve spermatositler) incelemek için gereklidir.
<ol><li>Spermatidler geliştirmeden kaynaklanan paraziti en aza indirmek için mümkün olduğunca genç sinekleri seçin.</li>
	<li>Karbondioksite kısa bir süre maruz kalarak sinekleri uyuşturun ve bir sineklik pedine aktarın14,15.</li>
	<li>Bir diseksiyon mi...

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Bu protokol, tüm mount yetişkin Drosophila testislerinin başarılı bir şekilde immünoblabeling için bir yöntem sağlar. Diğer prosedürlerde bildirildiği gibi, spermatositleri engelleme riski taşıyan spermin varlığını en aza indirmek için genç erkeklerin kullanılması gerekir (hatta eklosyondan sonra yaşı 20 saatten daha az bir süreye kısalttık). Diseksiyon hızlı olmalı ve antikor seyreltmesi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için ayarlanmalıdır21,...

Drosophila testisleri nükleer mimarinin incelenmesi için değerli bir modeldir. Mitotik spermatogonyal hücrelerde, nükleer hacim büyük ölçüde kromatin tarafından işgal edilir. Bu hücreler dört tur bölünmeye uğrar ve 16 birincil spermatosit kisti üretir. Sonraki birkaç gün boyunca, spermatositler 6 gelişim aşamasından (S1-S6) geçer, hacim olarak büyük ölçüde artar, yaklaşık olarak 20 kat1,2. Nükleer morfolojilerini de değiştiriyorlar. Lamin Dm0 tarafından ortaya çıkan çekirdeğin ana hatları düzensiz hale gelir ve derin invaginasyonları gösterir1,3. Buna kromatin organizasyonu 1 , 4 ,5,6,7 'de kapsamlı gen ekspresyasyonu değişiklikleri ve modifikasyonları eşlikeder. Ara evre kromozomları, S4-S5 evresinde iyi tanımlanmıştır ve 2 büyük çift değerli otomoz ve çekirdekle sabitlenmiş X-Y çiftine karşılık gelen üç ayrı kütle oluşturur.
Mad1 başlangıçta mitotik kontrol noktasının önemli bir bileşeni olarak izole edildi(8'degözden geçirildi). Interfazda, öncelikle nükleer zarfta değil, aynı zamanda nükleoplazma9, 10,11'dede bulunur. Drosophila testislerinde, Mad1'in nükleoplazmada belirgin olduğunu, iki büyük otozomal kromatin kütlesi ile yakından ilişkili olduğunu ve XY kromatin ile daha az ölçüde ilişkili olduğunu bildirdik. Kromatinle ilişkili bu yapıyı MINT (Mad1 içeren IntraNükleer Bölge)12olarak tanımladık. Diğer dört protein spermatositlerdeki MINT'lerle ilişkiliydi: nükleoporin Mtor / Tpr, SUMO peptidaz Ulp1, mitotik kontrol noktası proteini Mad2 ve Polikomla benzeri bir kompleksin alt bireyi Raf212.
MINT'lerin tanımını tamamlamak için antikor kullanmamız gerekiyordu ve testislerde genellikle immünostaining ile karşılaşılan teknik sorunlarla karşı karşıya kaldık: testislerin derinliğinde, özellikle de büyük spermatositlerde önemli bir homojenlik ile sonuçlanan zayıf bir geçirgenlik. Squashed preparatları antikor erişimini artırdı, ancak sıkıştırılmış görüntülere yol açtı, 3D analizleri kısıtladı ve kolokalizasyon da dahil olmak üzerenicel floresan ölçümünü önledi. Antikor penetrasyonu sorunu da % 0.3 Na deoksikollat13gibi permeabilizasyon edici ajanlar tarafından ele alınabiliyordu, ancak bu prosedür elimizde tekrarlanabilir sonuçlar vermedi. Birçok ortak etiketleme deneyi yaptığımız için, permeabilizasyon protokolünü geliştirmeye baktık. % 1 NP40 artı heptan kombinasyonu, özellikle büyük spermatositlerin incelenmesinde daha fazla tekrarlanabilirlik ile sonuçlandı.
Bu protokol, süspansiyondaki testislerin sabitlenmesi ve immünostainingini gerçekleştirir, numune kalitesini artırır, tekrarlanabilirliği artırır ve konfokal mikroskopi için uygun hale getirir. Protokolü, bazı nükleer zarf proteinlerinin büyük spermatositlerin nükleoplazmik yapılarıyla olan mekansal ilişkilerini daha iyi tanımlamak için kullandık. Bu yöntem, spermatosit gelişimine eşlik eden değişikliklerin, örneğin kromatin, nükleoplazma ve nükleer gözenekler de dahil olmak üzere çekirdeğin dinamik yapısal değişikliklerinin daha iyi araştırılmasına izin verecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

Drosophila testisleri kök hücre biyolojisi, nükleer mimari, meiosis ve sperm gelişimi dahil olmak üzere biyolojik süreçleri incelemek için güçlü bir model sistemidir. Bununla birlikte, tüm Drosophila testislerinin immünolabelingi genellikle antikor penetrasyonu nedeniyle lekelemenin önemli ölçüde homojen olmayanlığı ile ilişkilidir. Ezilmiş preparatlar, analizlerin 3D kalitesini azalttığı için sorunun sadece kısmen üstesinden gelmektedir. Burada, sıvı ortamda immünolabeling ile birlikte fiksasyon sırasında NP40 ve heptane kullanan tam montajlı bir protokol açıklıyoruz. Konfokal mikroskopiye uygun hacmi tekrarlanabilir ve güvenilir etiketleme ile birlikte korur. Konfokal bölümlerden spermatosit çekirdeğinin 3D rekonsesinin farklı örneklerini gösteriyoruz. İntra-ve inter-testes tekrarlanabilirliği, farklı genotiplerden tek hücreler arasındaki floresanların 3D nicelleştirilmesine ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu protokolü ve testislerin en büyük hücreleri olan S4-S5 spermatositleri üzerindeki uygulamalarını göstermek için intranükleer MINT yapısının (Mad1 içeren Intra Nükleer Bölge) farklı bileşenlerinin yanı sıra nükleer gözenek kompleksi ile ilişkili iki bileşen kullandık.

Drosophila testislerinin yeterli lekelenmesine yönelik en büyük engel, ezilmiş preparatlar kullanılarak kısmen çözülmüş olan ancak 3D analizlerin (örneğin 3D temsili veya kolokalizasyon ölçüsü) kısıtlanması pahasına antikorların sınırlı penetrability'dir. Prosedür tek tip etiketlemeye izin veriyor ve testislerin tüm hücrelerinin hacmini koruyor. Burada yöntemin illüstrasyonunu S4-S5 spermatositlerinin 3D temsiline odakladık, çünkü en büyük hücrelerdir ve böylece ezilme deformasyonuna...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...