Name: in situ chemotaxis assay to examine microbial behavior in aquatic ecosystems
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00
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Esta investigación fue financiada en parte por la Iniciativa de Microbiología Marina de la Fundación Gordon y Betty Moore, a través de la subvención GBMF3801 a J.R.S. y R.S., y un Premio investigador (GBMF3783) a R.S., así como una beca del Consejo Australiano de Investigación (DE160100636) a J.B.R., un premio de la Fundación Simons a B.S.L. (594111), y una subvención de la Fundación Simons (542395) a R.S. como parte de la Colaboración de Principios de Ecosistemas Microbianos (PriME).

Se recomienda ejecutar la sección 1 antes de los experimentos de campo para optimizar los resultados.
1. Optimización de laboratorio
NOTA: Los volúmenes descritos en el procedimiento de optimización son suficientes para un único ISCA (compuesto por 20 pozos).
<ol><li>Preparación del producto químico de interés NOTA: La concentración óptima para cada quimioatractant a menudo debe determinarse en condiciones de laboratorio antes de los despliegues sobre...

<ol>
	<li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients.">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li><li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis.">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li><li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces.">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li><li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria.">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li><li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity.">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li><li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+bacteria.">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li><li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility.">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li><li>Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+bacterial+chemotaxis.">Microfluidics for bacterial chemotaxis.</a> Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).</li><li>Hol, F. J. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooming+in+to+see+the+bigger+picture:+microfluidic+and+nanofabrication+tools+to+study+bacteria.">Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria.</a> Science. 346, 1251821 (2014).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities.">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li><li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I.">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li><li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+chemotaxis+of+Rhizobium+leguminosarum+and+other+bacteria+towards+root+exudates+from+legumes+and+other+plants.">Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants.</a> Microbiology. , (1982).</li><li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+exudation+and+rhizosphere+biology.">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li></ol>

A escala de microorganismos acuáticos, el medio ambiente está lejos de ser homogéneo y a menudo se caracteriza por gradientes físicos/químicos que estructuran las comunidades microbianas1,,15. La capacidad de los microorganismos móviles para utilizar el comportamiento (es decir, quimiotaxis) facilita la bifurcación dentro de estos microambientes heterogéneos1. Estudiar la quimiotaxis directamente en el medio ambiente tiene el poten...

Diversos microorganismos utilizan motilidad y quimiotaxis para explotar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar huéspedes, o evitar condiciones perjudiciales1,2,3. Estos comportamientos microbianos pueden a su vez influir en las tasas de transformación química4 y promover asociaciones simbióticas en los ecosistemas terrestres, de agua dulce y marinos2,,5.
La quimiotaxis ha sido ampliamente estudiada en condiciones de laboratorio durante los últimos 60 años6. El primer método cuantitativo para estudiar la quimiotaxis, el ensayo capilar, consiste en un tubo capilar lleno de un quimioatractante putativo sumergido en una suspensión de bacterias6. La difusión del producto químico fuera del tubo crea un gradiente químico, y las bacterias quimiotácticas responden a este gradiente migrando al tubo7. Desde el desarrollo del ensayo capilar, todavía ampliamente utilizado hoy en día, se han desarrollado muchas otras técnicas para estudiar la quimiotaxis en condiciones físicas/químicas cada vez más controladas, con la más reciente implicación del uso de microfluidos8,,9,,10.
Los microfluídicos, junto con la microscopía de vídeo de alta velocidad, permiten rastrear el comportamiento de las células individuales en respuesta a gradientes cuidadosamente controlados. Aunque estas técnicas han mejorado enormemente nuestra comprensión de la quimiotaxis, se han limitado al uso en laboratorio y no se traducen fácilmente en el despliegue de campo en los sistemas ambientales. Como consecuencia, no se ha examinado la capacidad de las comunidades naturales de bacterias para utilizar quimiotaxis dentro de los ecosistemas naturales; por lo tanto, la comprensión actual de la importancia ecológica potencial de la quimiotaxis está sesgada hacia condiciones de laboratorio artificiales y un número limitado de aislados bacterianos cultivados en laboratorio. El ISCA recientemente desarrollado supera estas limitaciones11.
La ISCA se basa en el principio general del ensayo capilar; sin embargo, hace uso de técnicas modernas de microfabricación para entregar una plataforma experimental altamente replicada y fácilmente desplegable para la cuantificación de la quimiotaxis hacia compuestos de interés en el medio natural. También permite la identificación y caracterización de microorganismos quimiotácticos mediante aislamiento directo o técnicas moleculares. Mientras que el primer dispositivo de trabajo fue autofabricado y construido de vidrio y PDMS11, la última versión moldeada por inyección se compone de policarbonato, utilizando un procedimiento de fabricación altamente estandarizado (para el interés en la última versión del dispositivo, se puede contactar con los autores correspondientes).
El ISCA es del tamaño de una tarjeta de crédito y consta de 20 pozos distribuidos en una matriz de 5 x 4 pozos, cada uno vinculado al medio acuático externo por un pequeño puerto (800 m de diámetro; Figura 1). Los quimioatractantes putativos cargados en los pozos se difunden en el medio ambiente a través del puerto, y los microbios quimiotácticos responden nadando a través del puerto en el pozo. Como muchos factores pueden influir en el resultado de un experimento ISCA en el entorno natural, este protocolo paso a paso ayudará a los nuevos usuarios a superar posibles obstáculos y facilitar implementaciones eficaces.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic glue</td>
			<td>Evonik</td>
			<td>1133</td>
			<td>Acrifix 1S 0116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8505K725</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>3M 810</td>
			<td>Scotch Magic tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>D-200</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75002451</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungee cord</td>
			<td>Paracord Planet</td>
			<td>667569184000</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube - 2 mL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td>Eppendorf tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube - 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11507411</td>
			<td>Falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube - 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>Falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deployment arm</td>
			<td>Irwin</td>
			<td>1964719</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deployment enclosure plug</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-236-4</td>
			<td>See alternatives in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable wipers</td>
			<td>Kimtech - Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>C09756</td>
			<td>CYTOFlex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td>SYBR Green I - 1:10,000 final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C3235</td>
			<td>Sterivex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Contact corresponding authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>Epilog Laser</td>
			<td>Fusion pro 32</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine Broth 2216</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-006</td>
			<td>Difco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon slotted flat head screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92929A243</td>
			<td>M 2 &#215; 4 &#215; 8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 1 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-236-2A</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 20 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-236-4</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips - 200 &#181;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-236-1</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>For artificial seawater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette - 50 mL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SIAL1490-100EA</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter - 0.02 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA68091002</td>
			<td>Anatop filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter - 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10695211</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 27G</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td>0.4 &#215; 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 1 mL</td>
			<td>Codau</td>
			<td>329650</td>
			<td>Insulin Luer U-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>303134</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>15899152</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack - 15 mL</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159V80</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack - 50 mL</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159V80</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8305A77</td>
			<td>Or different company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter - 0.2 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Steritop filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ chemotaxis assay to examine microbial behavior in aquatic ecosystems

Los comportamientos microbianos, como la motilidad y la quimiotaxis (la capacidad de una célula para alterar su movimiento en respuesta a un gradiente químico), están muy extendidos en los dominios bacteriano y arqueal. La quimiotaxis puede dar lugar a ventajas sustanciales de adquisición de recursos en entornos heterogéneos. También desempeña un papel crucial en las interacciones simbióticas, enfermedades, y procesos globales, como el ciclo biogeoquímico. Sin embargo, las técnicas actuales restringen la investigación de quimiotaxis al laboratorio y no son fácilmente aplicables en el campo. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el despliegue del ensayo de quimiotaxis in situ (ISCA), un dispositivo que permite un interrogatorio robusto de quimiotaxis microbiana directamente en el entorno natural. El ISCA es un dispositivo microfluídico que consiste en una matriz de 20 pozos, en la que se pueden cargar productos químicos de interés. Una vez desplegados en ambientes acuosos, los productos químicos se difunden fuera de los pozos, creando gradientes de concentración que los microbios detectan y responden nadando en los pozos a través de la quimiotaxis. El contenido del pozo se puede muestrear y utilizar para (1) cuantificar la fuerza de las respuestas quimiotácticas a compuestos específicos a través de la citometría de flujo, (2) aislar y cultivar microorganismos sensibles, y (3) caracterizar la identidad y el potencial genómico de las poblaciones que responden a través de técnicas moleculares. La ISCA es una plataforma flexible que se puede implementar en cualquier sistema con una fase acuosa, incluyendo ambientes marinos, de agua dulce y de suelo.

Esta sección presenta los resultados de laboratorio utilizando el ISCA para probar la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a un rango de concentración de glutamina, un aminoácido conocido por atraer bacterias del suelo14. La concentración de glutamina que provocó la respuesta quimiotáctica más fuerte en las pruebas de laboratorio se utilizó para realizar un ensayo de quimiotaxis en el medio marino.
Para realizar las pruebas de laboratorio, las comun...

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In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.

Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Nuestro protocolo nos permite cuantificar robustamente la quimiotaxis microbiana directamente en su hábitat doméstico. Y así podemos aislar microorganismos y podemos cuantificar y entender mejor el potencial metabólico. El ensayo de quimiotaxis in situ, o ISCA en resumen, es un dispositivo flexible, fácil de usar y simple que permite una nueva visión de los comportamientos microbianos y, por lo tanto, el papel y la función de los microorganismos en cualquier entorno que tenga una fase líquida.Demostrando el procedimiento de despliegue tanto en el laboratorio como en el campo está Estelle Clerc, que actualmente es estudiante de doctorado en mi grupo de investigación. Antes de preparar el quimioatractant, filtre el medio con un filtro de 0,2 micrómetros y autoclave la solución filtrada. A continuación, prepare una solución de 10 mililitrolares de quimioatractant en 1 mililitro del medio estéril y filtre la solución quimioatractant con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier partícula y contaminante potencial.A continuación, diluir la solución de quimioatractant filtrada en serie, de acuerdo con el protocolo experimental. Para llenar un ISCA, conecte una aguja de calibre 27 a una jeringa de 1 mililitro y cargue una jeringa para cada concentración del quimioatractant filtrado. Sosteniendo el dispositivo con el puerto hacia arriba, inyecte lentamente cada concentración de la sustancia en cada uno de los cinco pomos de una fila del dispositivo hasta que aparezca una pequeña gota en la parte superior de cada puerto.Cuando todos los pozos se han llenado, transferir 1,5 mililitros del cultivo de bacterias marinas o de agua dulce de interés en 150 mililitros del medio de cultivo bacteriano apropiado. A continuación, coloque dos pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara en la superficie plana de una bandeja de 200 mililitros de capacidad. Y asegure un ISCA en cada pieza de cinta.Con una pipeta serológica de 50 mililitros, llene lentamente la bandeja de despliegue con la solución bacteriana. Y permitir que las bacterias respondan al quimioatractant de interés durante una hora. Para finalizar el análisis, utilice una nueva pipeta de 50 mililitros para retirar suavemente el medio de la bandeja ISCA.Para recuperar las muestras, primero coloque el ISCA de modo que el puerto mire hacia abajo. A continuación, utilice una jeringa estéril de 1 mililitro equipada con una aguja de calibre 27 para extraer la solución de cada pozo. Tirar de las muestras de cada fila de la misma concentración en un solo tubo.Luego, analice las muestras por citometría de flujo para determinar el número de bacterias atraídas a cada concentración de quimioatractantes. Para preparar un ISCA para el despliegue en campo, primero, recoja 5 mililitros de agua por ISCA desde el lado del campo y filtre el agua a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Pase el agua filtrada de la jeringa a través de un cartucho de filtro GP hidrófilo dos veces, recogiendo el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, después de cada enjuague.A continuación, filtre el agua a través de un filtro de jeringa de 0,02 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Utilice alícuotas del filtrado para resuspender todos los quimioatractantes de interés a las concentraciones deseadas en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. A continuación, utilice jeringas de 10 mililitros para filtrar los quimioatractantes resuspendidos a través de filtros individuales de jeringa de 0,2 micrómetros en tubos estériles de centrífuga cónica de 15 mililitros para eliminar cualquier partícula no deseada o compuestos insolubles de agua.Para el despliegue en campo ISCA, atornille cada ISCA en la pieza 9 de la carcasa del dispositivo y cierre la carcasa. Selle la carcasa con cinta adhesiva y utilice cables de bungee para fijar la carcasa a un brazo de despliegue y a una estructura hecha por humanos. Alternativamente, el recinto se puede asegurar con un pequeño peso sobre un sustrato poco profundo o unido a una red en el océano Pelágico.Sumerja completamente la carcasa para iniciar el llenado, sosteniendo el cerramiento firmemente para evitar el movimiento excesivo del agua en el interior. Una vez que el nivel del agua haya llegado a la parte superior de la carcasa, asegúrese de que no haya aire atrapado en el interior. Cuando la carcasa esté completamente llena, selle los orificios inferior y superior con dos tapones.A continuación, deje el ISCA en su lugar durante 1 a 3 horas. Al final del período de muestreo, retire el cerramiento del agua. Coloque la carcasa sobre un recipiente para drenar el agua y retire cuidadosamente la parte superior de la cinta adhesiva de los orificios delanteros.Una vez que la línea de agua haya pasado por debajo de la parte superior de la ISCA, retire el tapón inferior y drene el resto del agua. Mientras que los ISCA todavía están conectados a la carcasa, utilice una pipeta de 1 mililitro, o una jeringa de 1 mililitro, para eliminar cuidadosamente el agua atrapada en la parte superior de cada ISCA y retirar los ISCA sin tocar la superficie superior. A continuación, utilice una toallita desechable para extraer el líquido restante en la superficie y recupere las muestras como se ha demostrado para la recuperación de la muestra de laboratorio.En este análisis in vitro representativo, se determinó que 1 mililolar era la concentración óptima de despliegue de glutamina, ya que inducía una respuesta quimiotáctica significativa que era 18 veces mayor que el control de agua de mar filtrada. Concentraciones más altas y más bajas de glutamina también indujo una respuesta quimiotáctica significativa, pero más débil. En este análisis de despliegue de campo, cinco réplicas de ISCA llenas de 1 glutamina milimétrica se desplegaron durante 1 hora en un sitio costero cerca de Sídney, Australia.Y la ISCA llena de glutamina atrajo casi tres veces más bacterias que los pozos de control llenos de agua de mar filtrada. Lo más importante a recordar al desplegar el ISCA, tanto en el laboratorio como en el campo, es evitar la creación de fuertes flujos de fluidos que prevengan la quimiotaxis. Las muestras derivadas de ISCA se pueden utilizar para identificar organismos o genes específicos, para caracterizar el potencial genómico de los organismos quimiotácticos y para el aislamiento específico de cepas específicas en medios selectivos.

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