Name: in vitro microfluidic disease model to study whole blood-endothelial interactions and blood clot dynamics in real-time
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00
Duration: 9 min 19 s
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Agradecemos a Jan Voorberg, do Departamento de Proteínas Plasmáticas, Sanquin Research e Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holanda, por sua contribuição neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Aliança CardioVascular Holandesa (DCVA) [2012-08, 2014-11] concedida ao Consórcio Phaedra e ao Reconecte, bem como a concessão do Impulso 2018 concedida ao consórcio Phaedra IMPACT. Essas bolsas incluem financiamento coletivo da Dutch Heart Foundation, Federação Holandesa de Centros Médicos Universitários, Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde e Academia Real de Ciências dos Países Baixos. Além disso, este trabalho foi financiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do programa Advanced Grant 'VESCEL' (Número de subvenção: 669768). O XDM é financiado por uma bolsa de pesquisa do Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) no VU University Medical Center, em Amsterdã, nos Países Baixos.

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Os autores não declaram conflito de interesses.

A coagulação é resultado da interação complexa e temporalmente controlada entre o endotélio e os componentes sanguíneos. Este ensaio in vitro apresenta um método para investigar propriedades trombogênicas das células endoteliais em tempo real. Vários tipos de células endoteliais humanas primárias podem ser usadas, facilitando a trombose in situ de forma específica do órgão e do paciente. Neste estudo, ilustramos o uso deste protocolo comparando propriedades trombogênicas de PAECs isolados de doadores saudáveis versus pacientes com CTEPH. A formação de trombos vivos foi estudada por perfusão de sangue inteiro de indivíduos saudáveis sobre endotélio ativado por histamina, enquanto o efeito de um DOAC foi testado como um agente antitrombótico.
Além do uso de microcanais disponíveis comercialmente, como mostrado nos resultados representativos, a introdução dos canais microfluidos personalizados permite o estudo da influência das mudanças de geometria vascular na formação de trombos. Por exemplo, a diminuição do fluxo em um ponto de ramificação ou estenose resulta em um aumento do estresse de cisalhamento e mais ativação plaquetária36. No entanto, uma limitação significativa desses canais microfluidos personalizados é a exigência de números de células elevadas para formar uma monocamada estável de CEs, conforme descrito na etapa 2.3.2. Isso pode apresentar um fator limitante quando as células derivadas do paciente são escassas. Os pontos fortes dos microslides disponíveis comercialmente são que as áreas superficiais são modificadas para a cultura celular e as áreas de crescimento são maiores, permitindo assim que os CES formem uma monocamada confluente e estável. Por outro lado, uma área de superfície maior resultará em um lúmen maior. De acordo com a Equação 1,isso requer maiores volumes sanguíneos para atingir taxas de fluxo semelhantes às dos microfluidos feitos sob medida.
Uma melhoria nesse protocolo pode ser investigar a perda de CE ao vivo ou mudanças na integridade da barreira. Os danos ce neste protocolo só são medidos no final do experimento. Para rastreamento ao vivo, os CES podem ser marcados com mCherry VE-cadherin, por exemplo37. No entanto, como isso precisaria de um protocolo altamente otimizado com transfecção eficiente do vírus, o Sensor de Impedância de Células Elétricas (ECIS) poderia ser usado como alternativa para estudar a integridade endotelial e a função de barreira38. A perfusão sobre canais especiais de fluxo ECIS permite o monitoramento longitudinal da integridade da barreira endotelial sob fluxo. Essas características específicas do ECIS permitem medições paralelas de propriedades de barreira endotelial e formação de trombos. Formas alternativas para medidas paralelas de barreira de CE, especialmente nas matrizes personalizadas incluem o uso de dextrans fluorescentes no perfusato, que difundem fora do lúmen, dependendo das propriedades da barreira CE.
Uma limitação do protocolo descrito é que as CES são removidas do corpo humano e cultivadas no plástico da cultura tecidual, que é um substrato rígido e artificial. As células se adaptam ao seu ambiente biofísico. Isso poderia possivelmente afetar a resposta endotelial à ativação da plaqueta, pois há associação entre ativação plaquetária e rigidez da parede39. Apesar dessas adaptações aos plásticos culturais, as células mantêm características específicas da doença que podem ser identificadas em comparação direta com os CEs derivados de doadores saudáveis, como mostrado com o controle, CTEPH-PAEC e HUVEC que exerciam diferentes padrões de adesão plaquetária e deposição fibrina após 5 minutos de perfusão sanguínea.
Em contraste com outros protocolos, este sistema utiliza sangue inteiro enquanto outros estudam a interação da CE com um único componente sanguíneo, como plaquetas e leucócitos19,,20,,21. Foram desenvolvidos modelos microfluidos mais avançados que permitem o estudo da função endotelial em um modelo vascular com geometria de vaso redondo e matriz extracelular macia. No entanto, estes são otimizados com HUVECs40,41,42. A novidade do protocolo descrito é o uso de CEs primários combinados com sangue inteiro trazendo a modelagem da trombose in situ um passo mais perto das condições in vivo. Ter otimizado o protocolo para o uso de CEs derivados do paciente e do sangue derivado do paciente otimiza ainda mais a modelagem da doença in vitro,permitindo a avaliação da formação personalizada de trombos e tratamento medicamentoso.
O protocolo descrito pode ser aplicado para estudar o efeito de terapias anticoagulação em células derivadas do paciente. Enquanto usamos dabigatran para inibir a formação de trombos, é possível usar outros anticoagulantes, como o rivaroxaban, que inibe diretamente o fator Xa na cascata de coagulação. Inibidores de plaquetas diretas como clopidogrel ou aspirina também podem ser estudados, pois estes agem na fase primária da hemostase onde plaquetas se ligam às CE. Em última análise, as capacidades trombogênicas das CEs específicas do paciente em interação com o próprio sangue do paciente podem ser usadas para prever o efeito pessoal da terapia anticoagulação no paciente individual. Além disso, um knockdown de proteínas específicas pode fornecer informações funcionais adicionais.
Existem algumas etapas no protocolo descrito que são fundamentais para um experimento de perfusão bem sucedido. Primeiro, durante o isolamento das células primárias, é necessário obter uma cultura ce altamente pura. Em segundo lugar, é importante que as CEs formem uma monocamada confluente estável. Se este não for o caso, uma pequena mudança no estresse da tesoura pode causar danos endoteliais e ativação da cascata de coagulação, ou plaquetas podem começar a se ligar à membrana do porão, o que fornecerá resultados falsos positivos. Em terceiro lugar, é essencial prevenir bolhas de ar, pois elas podem danificar o endotélio e, assim, influenciar os resultados.
Após a recalcificação do sangue citrado com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, é importante iniciar imediatamente o experimento de perfusão. A recalcificação induz uma resposta rápida na ativação plaquetária e na formação de trombos, resultando em coagulação rápida na amostra.
Em conclusão, descrevemos um protocolo altamente versátil para estudar interações células endoteliais sanguíneas inteiras durante a trombose.

O endotélio forma a camada celular interna dos vasos sanguíneos e separa o sangue do tecido circundante. Tem sido descrito como um órgão dinâmico que regula ativamente seu microambientso e responde a estímulos externos1. Devido ao seu contato direto com o sangue fluindo, o endotélio é fundamental no controle da hemostasia e da trombose e é a fonte primária de muitas das principais moléculas regulatórias que controlam a agregação plaquetária, coagulação e fibrinolise2. As células endoteliais saudáveis e não ativadas (CE) produzem várias moléculas que neutralizam a ativação plaquetária e impedem a coagulação e a formação de trombogramas para manter o fluxo sanguíneo, como prostacyclina, trombomodulina ou inibidor da via do fator tecidual (TFPI)2,,3. Isso impede a adesão de plaquetas, agregação de plaquetas e formação de trombos. Lesão ou ativação da parede do vaso resulta em um fenótipo endotelial procoagulante que inicia a adesão localizada de plaquetas e formação de coágulos2,4. Após a ativação endotelial, as plaquetas aderem ao von Willebrand Factor (VWF), uma proteína multimérica liberada das CES, ou a locais de ligação expostos da matriz subendotelial subjacente. Posteriormente, alterações moleculares nas plaquetas e exposição ao fator tecidual (TF) iniciam a ativação do sistema de coagulação, que induz a formação de trombos por polimerização fibrina5,,6. Em conjunto, o coágulo resultante fornece a base para o fechamento da ferida por reeterelialização7. Perturbações do sistema de coagulação podem resultar em distúrbios hemorrágicos, como doença de von Willebrand, hemofilia ou trombose, que muitas vezes resultam de um equilíbrio disregulado pró e antitombótico da via hemostática endotelial2,3.
O processo de hemostasia ocorre tanto na circulação arterial quanto venosa. No entanto, os mecanismos subjacentes à trombose arterial e venosa são fundamentalmente diferentes. Enquanto a trombose arterial, como visto na doença isquêmica do coração, é principalmente impulsionada pela ruptura de uma placa aterosclerótica em condições de alto estresse de tesoura, a trombose venosa desenvolve-se principalmente na ausência de lesão endotelial em condição de estase8,,9,10. Um trombo venoso profundo pode embolizar e viajar em direção às artérias pulmonares, onde causa uma embolia pulmonar. Isso pode resultar em obstruções vasculares crônicas que levam a capacidades funcionais significativas e prejudicadas que podem fomentar o desenvolvimento de doenças pulmonares chônicas, incluindo o desenvolvimento de hipertensão pulmonar tromboembólica crônica (CTEPH)11,,12,,13,14. CTEPH é caracterizado por pressão pulmonar elevada devido a obstruções das artérias pulmonares por material tromboembólico após pelo menos três meses de terapia anticoagulação15. Além da embolia pulmonar, é postulado que o endotélio pulmonar fornece um ambiente protombótico em CTEPH que facilita a trombose in situ e obstruções crônicas das artérias pulmonares, causando o aumento da pressão arterial que, em última análise, pode resultar em insuficiência cardíaca, se não tratada16,,17.
Ao longo dos últimos anos, vários estudos levaram ao desenvolvimento de ensaios para examinar a formação de trombos medindo a função plaqueta e a coagulação18. No entanto, a maioria deles estuda a interação do sangue inteiro com componentes de matriz extracelular única, como collagens ou fibrinas, ou função endotelial em interação com componentes sanguíneos únicos, como interação endotelial-plaqueta ou interação endotelial-leucócito19,20,,21,22. Esses ensaios são mais comumente realizados com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), pois essas células são facilmente obtidas. No entanto, os genes hemostáticos são expressos diferencialmente em toda a árvore vascular, tipos de vasos e sistemas de órgãos23,24, o que torna o uso de HUVECs para representar células endoteliais envolvidas em trombose arterial ou embolias pulmonares problemáticas23.
Além da plasticidade ce, alterações hemodinâmicas específicas da doença e alterações na morfologia vascular podem promover a formação de trombos no endotélionormal 25. Taxas mais elevadas de cisalhamento, devido à vasoconstrição local ou alterações na geometria do vaso, por exemplo, podem resultar em formação aguda de trombos, causando uma estenose que acelera a cessação do fluxo sanguíneo26. O uso de canais de fluxo microengenharia personalizados permite projetar especificamente geometrias vasculares representativas da (patho)biologia). Dessa forma, é possível estudar o efeito das forças biomecânicas locais na EC27saudável ou doente .
Existem terapias anticoagulação disponíveis para atingir diferentes fases e moléculas na cascata de coagulação, que todos representam riscos e benefícios particulares que podem ser específicos para certos transtornos. A abordagem da modelagem da doença descrita neste artigo é especialmente adequada para testar os efeitos de várias terapias anticoagulação e antiplaquetária na dinâmica do trombo.
O objetivo é apresentar um modelo de trombose que inclua ces primárias, produzindo um modelo versátil adequado para a análise de várias formas de trombose dependendo do tipo de CE primário utilizado. Como ilustração, utilizamos células endoteliais da artéria pulmonar de pacientes com CTEPH em interação com todo o sangue humano contendo todos os componentes envolvidos na formação de trombos (plaquetas, leucócitos, eritrócitos, proteínas coagulantes e cofatores). Essa abordagem pode ser aplicada em canais de fluxo paralelos comerciais ou em canais de fluxo microfluido personalizados com um desenho vascular específico. Como tal, o modelo pode eventualmente ser utilizado no estudo da formação e resolução de trombos, para a avaliação de respostas inflamatórias na modelagem de doenças, para terapia antiplaquetária ou anticoagulação e, finalmente, para medicina personalizada.
Este estudo descreve o isolamento das células endoteliais da artéria pulmonar humana primária. Para o isolamento de outros tipos primários de células endoteliais humanas, referimos-se a métodos publicados anteriormente, incluindo células endoteliais microvasculares pulmonares25, células endoteliais veia umbilical humana28, e colônia endotelial que circula sangue formando células Figura 1A29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">20 mL syringe</td>
			<td style="width:200px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:161px;">300613</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">20X objective</td>
			<td style="width:200px;">Olympus</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">2-Propanol (IPA)</td>
			<td style="width:200px;">Boom</td>
			<td style="width:161px;">76051455 . 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Aladdin Syringe Pump</td>
			<td style="width:200px;">Word Precision Instruments</td>
			<td style="width:161px;">AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa488-Fibrinogen</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F13191</td>
			<td>15 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa647 Goat anti Rabbit</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A21245</td>
			<td align="right">0.180555556</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex</td>
			<td style="width:200px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">15110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CaCl2</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Calcein AM-Red</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C3099</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CD42b-APC</td>
			<td style="width:200px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:161px;">130-100-208</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Citric Acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Collagen Typ I</td>
			<td style="width:200px;">Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:200px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">3295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cross-flow hood</td>
			<td style="width:200px;">Basan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Desiccator</td>
			<td style="width:200px;">Duran</td>
			<td>24 782 69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Endothelial Cell Medium (ECM)</td>
			<td style="width:200px;">ScienCell</td>
			<td style="width:161px;">1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Flow tubings</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td>10831, 10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">104070</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">H1399</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ibidi &#181;-Slide VI 0.4 flow chambers</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td style="width:161px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:200px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">v1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lab oven</td>
			<td style="width:200px;">Quincy</td>
			<td>10GC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LS720 Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:200px;">etaluma</td>
			<td style="width:161px;">LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luer connector</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td style="width:161px;">10802, 10825</td>
			<td>Male elbow connectors, and Female tube connectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">MACS magnetic beads (anti-CD144)</td>
			<td style="width:200px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:161px;">130-097-857</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">MgCl2</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscopy slides, 76 x 26 mm</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">AAAA000001##12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Negative photoresist, SU-8</td>
			<td>Microchem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td style="width:200px;">Lonza</td>
			<td style="width:161px;">13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">818715</td>
			<td>4% PFA in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140-122</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Plasma chamber, CUTE</td>
			<td style="width:200px;">Femto Science</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184</td>
			<td style="width:200px;">Dow</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">sodium citrate blood collection tubes</td>
			<td style="width:200px;">BD Vacutainer</td>
			<td style="width:161px;">363048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">trisodium citrate</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">6448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">VE-Cadherin (D87F2)-XP</td>
			<td style="width:200px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:161px;">2500</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro microfluidic disease model to study whole blood-endothelial interactions and blood clot dynamics in real-time

A formação de coágulos sanguíneos envolve interações complexas entre células endoteliais, sua matriz subjacente, várias células sanguíneas e proteínas. O endotélio é a fonte primária de muitas das principais moléculas hemostáticas que controlam a agregação plaquetária, coagulação e fibrinólise. Embora o mecanismo da trombose seja investigado há décadas, estudos in vitro se concentram principalmente em situações de dano vascular onde a matriz subendotelial é exposta, ou em interações entre células com componentes sanguíneos únicos. Nosso método permite estudar interações entre sangue inteiro e uma rede de células vasculares intactas e confluentes.
Ao utilizar células endoteliais humanas primárias, este protocolo oferece a oportunidade única de estudar a influência das células endoteliais na dinâmica do trombo e dá insights valiosos sobre a fisiopatologia da doença trombótica. O uso de canais de fluxo microfluido personalizados permite a aplicação de geometrias vasculares específicas da doença e modelam alterações vasculares morfológicas específicas. O desenvolvimento de um trombo é registrado em tempo real e quantitativamente caracterizado pela adesão plaqueta e deposição de fibrina. O efeito da função endotelial na dinâmica alterada do trombo é determinado pela pós-análise através da coloração da imunofluorescência de moléculas específicas.
Os resultados representativos descrevem a configuração experimental, coleta de dados e análise de dados. Dependendo da questão da pesquisa, os parâmetros para cada seção podem ser ajustados, incluindo tipo de célula, taxas de tesoura, geometria do canal, terapia medicamentosa e procedimentos pós-análise. O protocolo é validado pela quantificação da formação de trombos no endotélio da artéria pulmonar de pacientes com doença tromboembólica crônica.

Os resultados representativos podem ser divididos em três partes, cada uma representando as respectivas etapas de configuração experimental, coleta de dados e análise de dados. Dependendo da questão da pesquisa, os parâmetros para cada etapa podem ser alterados. Os dados apresentados são aplicados para estudar a influência do endotélio na formação de trombos.
Configuração experimental Está bem estabelecido que as células endoteliais são altamente heterogêneas em estrutura e função, dependendo da localização e do tempo, durante a saúde e a doença23. Várias fontes de células endoteliais podem ser usadas para estudar a interação endotelial-sangue, que neste caso estavam disponíveis comercialmente HUVECs e PAECs(Figura 1A). Os HUVECs têm sido os mais comumente utilizados em modelos de laboratório, enquanto os PAECs são células isoladas derivadas do paciente das artérias pulmonares. Além disso, existem protocolos bem estabelecidos disponíveis para isolar as células endoteliais microvasculares (MVEC) da circulação pulmonar ou da colônia endotelial que circula sangue (ECFC)25,,28,,29.
Após o isolamento, as células endoteliais foram caracterizadas pela mancha VE-cadherin, CD31 e TIE2 para confirmar um fenótipo endotelial. Caracterização para a presença de αSMA e citokeratina indicou a ausência de um fenótipo fibroblasto ou epitelial(Figura 1B). Após a obtenção de uma população altamente pura de CEs, as células de passagem 3-5 foram utilizadas para semear um microslídeo comercial ou canais de fluxo microfluido personalizados(Figura 1C). Embora os microslides disponíveis comercialmente sejam principalmente câmaras de fluxo paralelas, ou canais em forma de Y com parâmetros especificamente definidos em ângulo de altura ou bifurcação, o uso de lâminas microfluidas torna possível adaptar os parâmetros experimentais à geometria do vaso in vivo e à dinâmica do fluxo sanguíneo31. No entanto, os tamanhos microfluidos feitos sob medida são menores e tendem a limitar a propagação celular e induzir mais morte celular32,33. O uso de um excedente de células compensa o fato de que apenas uma pequena porcentagem de células vai aderir. Isso foi observado quando uma estenose foi introduzida, onde as células endoteliais apresentaram um fenótipo mais alongado em comparação com um canal microfluido paralelo(Figura 1D). As câmaras de fluxo comercial têm uma área de superfície maior a que as células podem se ligar. Isso requer menos números de células para semeadura.
Para estudar a interação endotelial célula-sangue, o sangue inteiro foi perfundido sobre uma monocamada endotelial. O sangue citrated foi coletado no dia do experimento e imediatamente antes da perfusão recalcificada. As células foram estimuladas com histamina para induzir a liberação de VWF e a adesão plaqueta 30 minutos antes da perfusão(Figura 1E)34,35. Devido às pequenas dimensões, os canais microfluidos personalizados permitiram o uso de volumes sanguíneos menores.
Coleta de dados Para investigar a formação de trombos em PAECs, calcein AM-Red fluorescentemente rotulado glóbulos e fibrina conjugada Alexa488 foram perfundidas por 5 min a 2,5 dyne/cm2 (Figura 2A–C). As células sanguíneas aderentes e a fibrina depositada foram quantificadas. As imagens foram adquiridas a cada 30 e quantificadas com ImageJ. Era importante subtrair o fundo para eliminar a autofluorescência de plaquetas não aadeadas. O algoritmo triângulo para limiar foi usado para definir o mínimo de fundo. Permitiu a medição de pequenos agregados de plaquetas(Figura 2D).
Espera-se que, em condições não estimuladas, não houvesse ligação de plaquetas e fibrina ao endotélio. Para promover a liberação de VWF e a ligação de plaquetas, os PAECs foram estimulados com histamina, o que resultou em um aumento imediato da adesão de plaquetas atingindo um patamar após 2,5 min. Nessa época, as plaquetas começaram a segregar fatores autocrinos que induziram a agregação de plaquetas e o decote fibrinogênio em fibrina. A fibrina foi depositada após 3 min e formou um agregado estável com plaquetas após 4 min (Figura 2E).
Para investigar se esse efeito poderia ser inibido por um anticoagulante oral direto (DOAC), o sangue foi tratado com dabigatran 10 nM. Dabigatran foi adicionado à diluição sanguínea, onde inibe o Fator IIa na via de coagulação, e impediu que o decote de fibrinogênio formasse fibras de fibrina. Quando o sangue tratado com dabigatran foi perfundido sobre PAECs estimulados, a formação de coágulos poderia ser diretamente inibida principalmente por retardar a deposição de fibrina(Figura 2F).
Análise de dados Para estudar a influência de várias fontes endoteliais na formação de trombos, foram analisadas as alterações celulares após 5 min de perfusão sanguínea. O endotélio foi fixado e as plaquetas aderentes foram rotuladas com CD42b antes da imagem sob um microscópio confocal. Isso forneceu uma análise detalhada para colocalização de plaquetas e fibrina que poderia indicar fatores de coagulação disfuncional no sangue. A influência da CE na formação de coágulos foi determinada pela coloração imunofluorescente padrão. Os contatos entre células celulares endoteliais foram mantidos, conforme confirmado pela coloração VE-cadherin, indicando que os coágulos sanguíneos se formaram em cima da monocamada endotelial em vez da matriz subjacente entre as lacunas endoteliais(Figura 3). Além disso, o uso de diferentes fontes celulares resultou em diferentes padrões de trombo se formando no endotélio. Os HUVECs são células endoteliais venosas e apresentaram adesão limitada de plaquetas e deposição fibrina, enquanto os pacientes do CTEPH apresentaram adesão de plaquetas abundantes e mais deposição fibrina sobre a estimulação de histamina em comparação com o PAEC saudável. Isso sugere que o endotélio dos pacientes com CTEPH mostra maior capacidade de resposta à vasoativação que resulta em aumento da formação de trombos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo. (A) Várias fontes e diferentes tipos de células endoteliais foram isoladas e cultivadas para uso em um canal de fluxo microfluido para experimentos de perfusão. Imagens representativas de brightfield de diferentes tipos de células endoteliais. Barra de escala = 50 μm. (B) As células isoladas foram caracterizadas pela coloração imunofluorescente para confirmar um fenótipo endotelial. Barra de escala = 50 μm. (C) As células podem ser semeadas em slides de fluxo comercial ou canal microfluido personalizado. (D) Imagens de campo brilhante representativas do HUVEC cultivadas em diferentes geometrias de canal. Barra de escala = 50 μm. (E) Configuração experimental de experimentos de perfusão sanguínea. O sangue citrated foi coletado, diluído com tampão salino, e perfundido sobre células endoteliais com uma bomba de seringa. A veia pulmonar e umbilical nesta figura foram modificadas a partir da Arte Médica Servier, licenciada sob uma Licença Genérica De Atribuição Comum Criativa 3.0. http://smart.servier.com/ Clique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Figura 2: Aquisição de imagem e quantificação da formação de trombos. (A) Imagem de lapso de tempo representativo de plaquetas rotuladas calcein AM-Red e fibrina conjugada alexa488 depositada em 1, 3 e 5 min após perfusão de sangue total sobre PAECs não estimulados(B)e sobre PAECs estimulados por histamina. (C) Imagens representativas de lapso de tempo de adesão plaqueta e depoimento de fibrina em 1, 3, e 5 min de perfusão com sangue inteiro incubado com dabigatran perfused sobre PAECs estimulados por histamina. Barra de escala = 50 μm. (D) Visão geral esquemática da quantificação da imagem no ImageJ. (E) Quantificação da adesão plaquetária e deposição de fibrina para cada 30 s em um endotélio não estimulado e histamina estimulada. (F) Quantificação do efeito de dabigatran na formação de trombos quantificado por adesão plaqueta e deposição de fibrina. Os dados são representados como média ± SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Figura 3: Imagens confocalas representativas de experimentos de fluxo para caracterizar a formação de trombos na adesão plaquetária e deposição de fibrina em células endoteliais. Os contatos celulares endoteliais foram caracterizados por VE-cadherin e medidos em PAECs de controle, PAECs CTEPH derivados do paciente e HUVEC. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Este Modelo de Doença In Vitro, pode ser usado para estudar a interação de células derivadas de sangue inteiro e paciente, especificamente a endotelial, para avaliar a trombogenicidade e a eficácia dos agentes anticoagulantes. Estas células de endotélio podem ser usadas em várias circunstâncias e podem ser modificadas introduzindo microfluidos personalizados ou ajustando parâmetros de fluxo sanguíneo. Além disso, este modelo pode ser usado para estudar a dinâmica do trombo em condições inflamatórias, ou para avaliar os efeitos da terapia anticoagulante e antiplaquelet.Em última análise, essas abordagens podem ser usadas em um método de medicina personalizada. Depois de obter uma amostra cirúrgica de tecido arterial pulmonar humano, cubra a célula de alta afinidade com 60 mililitros de cultura celular com dois mililitros de cinco microgramas por mililitro fiboronectina e incubar o prato a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. No final da incubação, use fórceps estéreis em um armário de fluxo laminar em condições estéreis, para transferir o tecido para uma placa de Petri de PBS.Se o tecido ainda estiver em um anel, corte a artéria aberta com uma tesoura, tomando cuidado para não tocar na camada mais interna do vaso, pois o endotélio é facilmente danificado e removido. Depois de remover a fibronectina, adicione quatro mililitros de meio completo de célula endotelial ao prato e use fórceps para transferir a amostra de tecido para o meio, use um bisturi para raspar cuidadosamente a camada interna do vaso no meio, tomando cuidado para evitar quaisquer acúmulos lipídicos que são observados na parede do vaso. Depois que as células tiverem sido colhidas, coloque a placa na incubadora de cultura celular.Se os fibroblastos contaminarem a cultura, use a separação celular de afinidade magnética para um CD144, de acordo com as instruções do fabricante para purificar as células. Geralmente, a cultura é definida como pura, quando a citometria de fluxo detecta 10% ou menos células contaminantes. Quando o número suficiente de células endoteliais foram obtidas para uso experimental, as células endoteliais primárias podem ser caracterizadas pela presença de marcadores específicos de células endoteliais e pela ausência de marcadores musculares lisos e células epiteliais.Para a preparação da câmara de fluxo, código um canal de um slide de fluxo de seis poços com 30 microliters de 0,1% de gelatina e incubar este slide por pelo menos 15 minutos a 37 graus Celsius. Além das câmaras de fluxo comerciais, câmaras de fluxo personalizadas com dimensões específicas podem ser usadas para estudar a influência da geometria vascular na dinâmica do coágulo. Enquanto o slide está incubando, coletar as células de uma cultura de células endoteliais confluentes da artéria pulmonar com EDTA e trypsin e sedimentos que células por centrifugação, suspender a pelota em 600 microliters de células endoteliais completas médias e vigorosamente, mas suavemente, adicionar 100 microliters de células em cada canal, adicionar um adicional de 50 microliters de células endoteliais completas ao meio do canal , para fornecer meio suficiente para incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, mude o meio no dia seguinte para lavar as células desvinculas.Após seis dias na cultura, as células deveriam ter formado uma monocamada confluente estável. No sétimo dia da cultura das células endoteliais da artéria pulmonar, adquira amostras de sangue venoso de indivíduos que não recebem tratamento anticoagulativo em 109 tubos anticoagulantes de citrato monossódico e transfiram o sangue para um tubo de 50 mililitros. O sangue pode conter vírus e outros agentes infecciosos.Por isso, é importante sempre usar luvas e seguir as orientações de segurança para trabalhar com material humano. Fluorescente rotulou os glóbulos com 1 a 10.000 de concentração de Calcein AM Red e 50 microgramas por mililitro e adicionar Alexa 488 fibrinogen, em seguida, incubar o sangue a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a absorção completa. 30 minutos antes da perfusão, trate as células endoteliais da artéria pulmonar com 100 microliters de uma histamina micromolar em células endoteliais média e 1% soro bovino fetal sem quaisquer outros aditivos.E use uma seringa de 20 mililitros cheia de tampão de lavagem para enxaguar os tubos do sistema de fluxo, carregue uma seringa de 3 a 20 mililitros com dois mililitros de tampão de lavagem e carregue a seringa em uma bomba de seringa. Use uma segunda seringa de 20 mililitros para encher os tubos de fluxo com hippies mais tampão contendo albumina de soro bovino de 1% e use um conector Laura em forma de cotovelo para conectar cuidadosamente os tubos ao micro slide, conecte a saída do slide à seringa, repare a partir de microscopia colocando a célula contendo slide no palco e montando a configuração para o experimento , ajuste o microscópio e defina os parâmetros para a imagem. Recalcificação de sangue enfático.E este é um feliz co-patrocinador de coagulação, além disso tente evitar a formação de bolhas de ar porque isso danificará a camada celular endotelial e influenciará seus resultados. Imediatamente antes da perfusão, diluir o sangue em dois momentos com tampão de recalcificação e colocar o tubo de entrada do micro slide no tubo de sangue, pressione comece a bomba de seringa. Assim que o sangue começar a fluir sobre o endotélio, pressione o microscópio para adquirir imagens usando os canais ativos pré-selecionados e posições de região de interesse, a cada 15 segundos por cinco minutos.No final da análise, pare a gravação e a bomba de seringa e limpe corretamente. A rotulagem de plaquetas com Calcein AM Red e a adição de Fibrinogen conjugado Alexa 488, permite a investigação da formação de trombos por aderência plaqueta e fibra e deposição. Em condições não estimuladas, não há vinculação de plaquetas ou fibrina ao endotélio.A estimulação com histamina resulta em um aumento imediato na adesão plaqueta, que atinge um platô após 2,5 minutos, neste momento, as plaquetas começam a segregar fatores autocrinos que induzem uma agregação plaqueta e decote fibrinogênio à fibrinão, resultando em fibra e deposição em três minutos e a formação de um agregado estável com as plaquetas após quatro minutos. O tratamento com anticoagulante direto inibe a formação de coágulos e a adesão plaqueta em comparação com o sangue não tratado. A análise imunofluorescente das interações de plaquetas de células endoteliais da artéria pulmonar após cinco minutos de perfusão, revela a manutenção da célula endotelial, contatos celulares, conforme confirmado pela coloração da cadherina endotelial vascular, indicando que os coágulos sanguíneos se formam em camadas de modelo endotelial em vez da matriz subjacente entre as lacunas endoteliais.as células endoteliais da veia umbilical humana demonstram menos adesão plaquetária e deposição fibrina em comparação com o endotélio da artéria pulmonar. Notavelmente, as células endotelias da artéria pulmonar primária doente de pacientes com hipertensão pulmonar tromboembólica crônica, apresentam uma adesão plaquetária aumentada e mais deposição de fibrina em comparação com células saudáveis. A trombogenicidade do endotélio depende de múltiplos fatores como a origem do leito vascular ou as partes de fundo biológico.Utilizando este protocolo, disfunções intrínsecas em componentes vasculares e sanguíneos, bem como a eficácia da terapia anticoagulada podem ser testadas durante diferentes fases da hemostase trombose. Este protocolo pode ser usado para entender as interações de sangue e Theo, em várias doenças tromboembólicas com o potencial final de prever respostas específicas do paciente à terapia anticoagulação.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...