Name: in vitro microfluidic disease model to study whole blood-endothelial interactions and blood clot dynamics in real-time
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00
Duration: 9 min 19 s
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Agradecemos a Jan Voorberg, del Departamento de Proteínas de Plasma, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Países Bajos, por su aportación en este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] otorgada a Phaedra y el consorcio Reconnect, así como la subvención Impulse 2018 otorgada al consorcio Phaedra IMPACT. Estas subvenciones incluyen financiación colectiva de la Fundación Holandesa del Corazón, la Federación Holandesa de Centros Médicos Universitarios, la Organización Neerlandesa para la Investigación y el Desarrollo de la Salud y la Real Academia neerlandesa de Ciencias. Además, este trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de Subvenciones Avanzadas «VESCEL» (Número de subvención: 669768). XDM está financiado por una beca de investigación del Instituto de Investigación Cardiovascular (ICaR-VU) en el Vu University Medical Center, Amsterdam, Países Bajos.

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	<li>Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+control+of+thrombosis.">Endothelial cell control of thrombosis.</a> BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).</li><li>Pearson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+function+and+thrombosis.">Endothelial cell function and thrombosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).</li><li>Bochenek, M. L., Schafer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Endothelial+Cells+in+Acute+and+Chronic+Thrombosis.">Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis.</a> Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).</li><li>Swieringa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Control+of+Fibrin+Distribution+and+Microelasticity+in+Thrombus+Formation+Under+Flow.">Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).</li><li>Macfarlane, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Enzyme+Cascade+in+the+Blood+Clotting+Mechanism,+and+Its+Function+as+a+Biochemical+Amplifier.">An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier.</a> Nature. 202, 498-499 (1964).</li><li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fundamentals+in+hemostasis.">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).</li><li>Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+platelets,+the+coagulation+and+fibrinolytic+systems+to+cutaneous+wound+healing.">Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing.</a> Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).</li><li>Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+cellular+biology+of+atherosclerosis.">Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).</li><li>Karino, T., Motomiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+a+venous+valve+and+its+implication+for+thrombus+formation.">Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation.</a> Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).</li><li>ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis:+a+major+contributor+to+global+disease+burden.">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).</li><li>Witkin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pulmonary+embolism:+the+role+of+the+pulmonary+embolism+response+team.">Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team.</a> Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).</li><li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension.">Chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).</li><li>Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+biomarkers+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension.">Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).</li><li>Giri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interventional+Therapies+for+Acute+Pulmonary+Embolism:+Current+Status+and+Principles+for+the+Development+of+Novel+Evidence:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).</li><li>Sharma, S., Lang, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+pathophysiology+of+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension.">Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).</li><li>Eisenberg, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinopeptide+A+levels+indicative+of+pulmonary+vascular+thrombosis+in+patients+with+primary+pulmonary+hypertension.">Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension.</a> Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).</li><li>Bochenek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+thrombosis+to+fibrosis+in+chronic+thromboembolic+pulmonary+hypertension.">From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).</li><li>Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+microfluidics+to+assess+the+platelet-based+control+of+coagulation.">Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation.</a> Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).</li><li>Barendrecht, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Platelet+Degranulation+and+Secretion+Under+Flow.">Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).</li><li>Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets.">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).</li><li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).</li><li>Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stasis+Promotes+Erythrocyte+Adhesion+to+von+Willebrand+Factor.">Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).</li><li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brothers+and+sisters:+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity.">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).</li><li>Szulcek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Microvascular+Shear+Adaptation+in+Pulmonary+Arterial+Hypertension.+Role+of+Platelet+Endothelial+Cell+Adhesion+Molecule-1+Cleavage.">Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).</li><li>Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high+shear+rate+in+thrombosis.">Role of high shear rate in thrombosis.</a> Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+whole+blood+thrombosis+in+a+microfluidic+device+lined+by+fixed+human+endothelium.">Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium.</a> Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+prolonged+increase+in+endothelial+permeability+induced+by+histamine+and+thrombin:+role+of+protein+kinases,+calcium,+and+RhoA.">Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA.</a> Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).</li><li>Smits, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Outgrowth+and+Proliferation+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+are+Related+to+Markers+of+Disease+Severity+in+Patients+with+Pulmonary+Arterial+Hypertension.">Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).</li><li>Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+serial+hemodilution+with+hydroxyethyl+starch,+albumin,+and+0.9%+saline+on+whole+blood+coagulation.">Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation.</a> Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics.">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li><li>Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+peptides+enhance+single+cell+adhesion+and+viability+on+microarrays.">Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays.</a> Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).</li><li>Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+size-dependent+cell+adhesion+on+nanostructured+interfaces.">Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces.</a> Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).</li><li>McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weibel-Palade+bodies+at+a+glance.">Weibel-Palade bodies at a glance.</a> Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).</li><li>Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mast+Cell,+Contact,+and+Coagulation+System+Connection+in+Anaphylaxis.">The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).</li><li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner.">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li><li>Huveneers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinculin+associates+with+endothelial+VE-cadherin+junctions+to+control+force-dependent+remodeling.">Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling.</a> Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).</li><li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation,+barrier+function,+and+motility.">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).</li><li>Yamasaki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+arterial+stiffness+and+platelet+activation.">Association between arterial stiffness and platelet activation.</a> Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).</li><li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).</li></ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

La coagulación es el resultado de la interacción compleja y controlada temporalmente entre el endotelio y los componentes sanguíneos. Este ensayo in vitro presenta un método para investigar las propiedades trombogénicas de las células endoteliales en tiempo real. Se pueden utilizar varios tipos de células endoteliales humanas primarias, facilitando la trombosis in situ de una manera específica del órgano y del paciente. En este estudio, ilustramos el uso de este protocolo comparando las propiedades trombogénicas de los PAEC aislados de donantes sanos frente a los pacientes con TEPH. La formación de trombos vivos se estudió por perfusión de sangre entera de sujetos sanos sobre el endotelio activado por histamina, mientras que el efecto de un DOAC se probó como un agente antitrombótico.
Además del uso de microcanales disponibles comercialmente, como se muestra en los resultados representativos, la introducción de los canales microfluídicos hechos a medida permite el estudio de la influencia de los cambios de geometría vascular en la formación de trombos. Por ejemplo, el flujo disminuye en un punto de rama o estenosis da como resultado un aumento en la tensión de cizallamiento y una mayor activaciónplaquetaria 36. Sin embargo, una limitación significativa de estos canales microfluídicos hechos a medida es el requisito de números de celdas altos para formar una monocapa estable de ECs como se describe en el paso 2.3.2. Esto puede presentar un factor limitante cuando las células derivadas del paciente son escasas. Los puntos fuertes de los microdeslizos disponibles comercialmente son que las áreas superficiales se modifican para el cultivo celular y las áreas de crecimiento son más grandes, lo que permite a los CIE formar una monocapa confluente y estable. Por otro lado, una superficie más grande resultará en un lumen más grande. Según la Ecuación 1,esto requiere mayores volúmenes de sangre para alcanzar velocidades de flujo similares a las de los microfluídicos hechos a medida.
Una mejora de este protocolo podría ser investigar la pérdida de EC en vivo o los cambios en la integridad de la barrera. Los daños de la CE en este protocolo sólo se miden al final del experimento. Para el seguimiento en vivo, los ECs se pueden etiquetar con mCherry VE-cadherin, por ejemplo37. Sin embargo, como esto necesitaría un protocolo altamente optimizado con transfección de virus eficiente, la detección de impedancia de sustrato de células eléctricas (ECIS) podría utilizarse como una alternativa para estudiar la integridad endotelial y la función de barrera38. La perfusión sobre canales de flujo ECIS especiales permite la monitorización longitudinal de la integridad de la barrera endotelial bajo flujo. Estas características específicas de ECIS permiten mediciones paralelas de propiedades de barrera endotelial y formación de trombos. Las formas alternativas para las mediciones de barreras EC paralelas, especialmente en los arreglos a medida, incluyen el uso de dextrans fluorescente en el perfusado, que se difunden fuera del lumen, dependiendo de las propiedades de barrera de la CE.
Una limitación del protocolo descrito es que los EC se eliminan del cuerpo humano y se cultivan en plástico de cultivo de tejidos, que es un sustrato rígido y artificial. Las células se adaptan a su entorno biofísico. Esto podría afectar a la respuesta endotelial a la activación plaquetaria, ya que existe una asociación entre la activación plaquetaria y la rigidez de la pared39. A pesar de estas adaptaciones a los plásticos de cultivo, las células mantienen características específicas de la enfermedad que se pueden identificar en comparación directa con las CE derivadas de donantes sanos como se muestra con el control, CTEPH-PAEC, y HUVEC que ejerció diferentes patrones de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina después de 5 minutos de perfusión de sangre.
A diferencia de otros protocolos, este sistema utiliza sangre entera, mientras que otros estudian la interacción de la CE con un único componente sanguíneo como plaquetas y leucocitos19,,20,,21. Se han desarrollado modelos microfluídicos más avanzados que permiten el estudio de la función endotelial en un modelo vascular con geometría de recipiente redondo y matriz extracelular suave. Sin embargo, estos están optimizados con HUVECs40,,41,42. La novedad del protocolo descrito es el uso de ECs primarios combinados con sangre entera que acerca el modelado de la trombosis in situ un paso más cerca de las condiciones in vivo. Una vez optimizado el protocolo para el uso de ECs derivadas del paciente y la sangre derivada del paciente, optimiza aún más el modelado de enfermedades in vitro,lo que permite evaluar la formación personalizada de trombos y el tratamiento farmacológico.
El protocolo descrito se puede aplicar para estudiar el efecto de las terapias de anticoagulación en las células derivadas del paciente. Mientras que usamos dabigatrán para inhibir la formación de trombos, es posible utilizar otros anticoagulantes, como el rivaroxabán, que inhibe directamente el factor Xa en la cascada de coagulación. También se pueden estudiar inhibidores de plaquetas directas como clopidogrel o aspirina, ya que actúan en la fase primaria de la hemostasia, donde las plaquetas se unen a las CE. En última instancia, las capacidades trombogénicas de las ECs específicas del paciente en interacción con la propia sangre del paciente se pueden utilizar para predecir el efecto personal de la terapia de anticoagulación en el paciente individual. Además, un derribo de proteínas específicas puede proporcionar información funcional adicional.
Hay algunos pasos en el protocolo descrito que son críticos para un experimento de perfusión exitoso. En primer lugar, durante el aislamiento de las células primarias, es necesario obtener un cultivo de EC altamente puro. En segundo lugar, es importante que los ECs formen una monocapa confluente estable. Si este no es el caso, un ligero cambio en el estrés de cizallamiento puede causar daño endotelial y activación de la cascada de coagulación, o las plaquetas pueden comenzar a unirse a la membrana del sótano, lo que proporcionará resultados falsos positivos. En tercer lugar, es esencial prevenir las burbujas de aire, ya que pueden dañar el endotelio y así influir en los resultados.
Después de la recalcificación de la sangre citrated con cloruro de calcio y cloruro de magnesio, es importante iniciar inmediatamente el experimento de perfusión. La recalcificación induce una respuesta rápida en la activación plaquetaria y la formación de trombos, lo que resulta en una coagulación rápida en la muestra.
En conclusión, describimos un protocolo altamente versátil para estudiar interacciones de células endoteliales de sangre enteras durante la trombosis.

El endotelio forma la capa celular interna de los vasos sanguíneos y separa la sangre del tejido circundante. Se ha descrito como un órgano dinámico que regula activamente su microambiente y responde a estímulos externos1. Debido a su contacto directo con la sangre que fluye, el endotelio es fundamental en el control de la hemostasia y la trombosis y es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas reguladoras que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis2. Las células endoteliales sanas y no inactivadas (EC) producen varias moléculas que contrarrestan la activación plaquetaria y previenen la coagulación y la formación de trombos para mantener el flujo sanguíneo, como la prostaciclina, la trombomotritina o el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI)2,,3. Esto evita la adhesión de plaquetas, agregación plaquetaria y formación de trombos. La lesión o la activación de la pared del vaso da como resultado un fenotipo endotelial procoagulant que inicia la adhesión plaquetaria localizada y la formación de coágulos2,4. Tras la activación endotelial, las plaquetas se adhieren al factor von Willebrand (VWF), una proteína multimérica liberada de ECs, o a sitios de unión expuestos de la matriz subendotelial subyacente. Posteriormente, los cambios moleculares en las plaquetas y la exposición al factortisular(TF) inician la activación del sistema de coagulación, lo que induce la formación de trombos por polimerización de fibrina5,6. Juntos, el coágulo resultante proporciona la base para el cierre de la herida por re-endotelialización7. Las perturbaciones del sistema de coagulación pueden dar lugar a trastornos hemorrágicos, como la enfermedad de von Willebrand, la hemofilia o la trombosis, que a menudo resultan de un equilibrio pro y antitrombótico desregulado de la vía hemostatica endotelial2,,3.
El proceso de hemostasia se produce tanto en circulación arterial como venosa. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la trombosis arterial y venosa son fundamentalmente diferentes. Mientras que la trombosis arterial, como se ve en la cardiopatía isquémica, es impulsada principalmente por la ruptura de una placa aterosclerótica en condiciones de alto estrés de cizallamiento, trombosis venosa se desarrolla principalmente en ausencia de lesión endotelial en una condición de éxtasis8,,9,10. Un trombo venal profundo puede embolizarse y viajar hacia las arterias pulmonares, donde causa una embolia pulmonar. Esto puede dar lugar a obstrucciones vasculares crónicas que conducen a un deterioro significativo de las capacidades funcionales que podrían fomentar el desarrollo de enfermedades pulmonares chónicas, incluyendo el desarrollo de hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH)11,12,13,14. La CTEPH se caracteriza por una presión pulmonar elevada debido a obstrucciones de las arterias pulmonares por material tromboembólico después de al menos tres meses de terapia de anticoagulación15. Además de las embolias pulmonares, se postula que el endotelio pulmonar proporciona un ambiente protrombótico en la CTEPH que facilita la trombosis in situ y las obstrucciones crónicas de las arterias pulmonares, causando el aumento de la presión arterial que en última instancia puede resultar en insuficiencia cardíaca, si no se trata16,17.
En los últimos años, diversos estudios han llevado al desarrollo de ensayos para examinar la formación de trombos midiendo la función plaquetaria y la coagulación18. Sin embargo, la mayoría de ellos estudian la interacción de sangre entera con componentes de matriz extracelular individual como colágenos o fibrines, o función endotelial en interacción con componentes sanguíneos individuales, como la interacción endotelial-plaquetaria o endotelial-leucocitos19,,20,,21,,22. Estos ensayos se realizan más comúnmente con células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC), ya que estas células se obtienen fácilmente. Sin embargo, los genes hemostáticos se expresan diferencialmente a través del árbol vascular, los tipos de vasos y los sistemas de órganos23,24, lo que hace que el uso de HUVEC para representar células endoteliales implicadas en trombosis arterial o embolsias pulmonares problemático23.
Además de la plasticidad EC, las alteraciones hemodinámicas específicas de la enfermedad y los cambios en la morfología vascular pueden promover la formación de trombos en el endotelionormal 25. Las tasas de cizallamiento más altas, debido a la vasoconstricción local o a cambios en la geometría de los vasos, por ejemplo, pueden dar lugar a una formación aguda de trombos, causando una estenosis que acelera el cese del flujo sanguíneo26. El uso de canales de flujo microingenieros hechos a medida permite diseñar específicamente geometrías vasculares que son representativas de la biología (patho). De esta manera, es posible estudiar el efecto de las fuerzas biomecánicas locales en la EC27sana o enferma.
Existen terapias de anticoagulación disponibles para apuntar a diferentes fases y moléculas en la cascada de coagulación, que representan riesgos y beneficios particulares que pueden ser específicos de ciertos trastornos. El enfoque del modelado de enfermedades descrito en este documento es especialmente adecuado para probar los efectos de varias terapias de anticoagulación y antiplaquetarios en la dinámica del trombo.
El objetivo es presentar un modelo de trombosis que incluya ECs primarios, produciendo un modelo versátil adecuado para el análisis de diversas formas de trombosis dependiendo del tipo de ECs primarios utilizados. Como ilustración, utilizamos células endoteliales de la arteria pulmonar de pacientes con CTEPH en interacción con sangre humana entera que contiene todos los componentes involucrados en la formación de trombos (plaquetas, leucocitos, eritrocitos, proteínas de coagulación y cofactores). Este enfoque se puede aplicar en canales de flujo paralelos comerciales o en canales de flujo microfluídicos hechos a medida con un diseño vascular específico. Como tal, el modelo puede eventualmente ser utilizado en el estudio de la formación y resolución de trombos, para la evaluación de las respuestas inflamatorias en el modelado de enfermedades, para la terapia antiplaquetaria o anticoagulación, y en última instancia para la medicina personalizada.
Este estudio describe el aislamiento de las células endoteliales de la arteria pulmonar humana primaria. Para el aislamiento de otros tipos primarios de células endoteliales humanas, nos referimos a métodos publicados previamente, incluyendo células endoteliales microvasculares pulmonares25,células endoteliales de venas umbilicales humanas28, y colonia endotelial circulante de sangre formando células Figura 1A29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">20 mL syringe</td>
			<td style="width:200px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:161px;">300613</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">20X objective</td>
			<td style="width:200px;">Olympus</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">2-Propanol (IPA)</td>
			<td style="width:200px;">Boom</td>
			<td style="width:161px;">76051455 . 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Aladdin Syringe Pump</td>
			<td style="width:200px;">Word Precision Instruments</td>
			<td style="width:161px;">AL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa488-Fibrinogen</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F13191</td>
			<td>15 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Alexa647 Goat anti Rabbit</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A21245</td>
			<td align="right">0.180555556</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex</td>
			<td style="width:200px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">15110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CaCl2</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Calcein AM-Red</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C3099</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">CD42b-APC</td>
			<td style="width:200px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:161px;">130-100-208</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Citric Acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Collagen Typ I</td>
			<td style="width:200px;">Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:200px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">3295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cross-flow hood</td>
			<td style="width:200px;">Basan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Desiccator</td>
			<td style="width:200px;">Duran</td>
			<td>24 782 69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Endothelial Cell Medium (ECM)</td>
			<td style="width:200px;">ScienCell</td>
			<td style="width:161px;">1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Flow tubings</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td>10831, 10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">104070</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:200px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">H1399</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ibidi &#181;-Slide VI 0.4 flow chambers</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td style="width:161px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:200px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">v1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">KCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lab oven</td>
			<td style="width:200px;">Quincy</td>
			<td>10GC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LS720 Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:200px;">etaluma</td>
			<td style="width:161px;">LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Luer connector</td>
			<td style="width:200px;">ibidi</td>
			<td style="width:161px;">10802, 10825</td>
			<td>Male elbow connectors, and Female tube connectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">MACS magnetic beads (anti-CD144)</td>
			<td style="width:200px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:161px;">130-097-857</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">MgCl2</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microscopy slides, 76 x 26 mm</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">AAAA000001##12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Negative photoresist, SU-8</td>
			<td>Microchem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td style="width:200px;">Lonza</td>
			<td style="width:161px;">13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">818715</td>
			<td>4% PFA in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140-122</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Plasma chamber, CUTE</td>
			<td style="width:200px;">Femto Science</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184</td>
			<td style="width:200px;">Dow</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">sodium citrate blood collection tubes</td>
			<td style="width:200px;">BD Vacutainer</td>
			<td style="width:161px;">363048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">trisodium citrate</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">6448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">VE-Cadherin (D87F2)-XP</td>
			<td style="width:200px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:161px;">2500</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro microfluidic disease model to study whole blood-endothelial interactions and blood clot dynamics in real-time

La formación de coágulos sanguíneos implica interacciones complejas entre las células endoteliales, su matriz subyacente, varias células sanguíneas y proteínas. El endotelio es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas hemostáticas que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis. Aunque el mecanismo de trombosis se ha investigado durante décadas, los estudios in vitro se centran principalmente en situaciones de daño vascular donde la matriz subendotelial se expone, o en interacciones entre células con componentes sanguíneos individuales. Nuestro método permite estudiar las interacciones entre toda la sangre y una red de células vasculares intacta y confluente.
Mediante la utilización de células endoteliales humanas primarias, este protocolo proporciona la oportunidad única de estudiar la influencia de las células endoteliales en la dinámica del trombo y proporciona información valiosa sobre la fisiopatología de la enfermedad trombótica. El uso de canales de flujo microfluídicos hechos a medida permite la aplicación de geometrías vasculares específicas de la enfermedad y modelan cambios vasculares morfológicos específicos. El desarrollo de un trombo se registra en tiempo real y cuantitativamente caracterizado por la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina. El efecto de la función endotelial en la dinámica alterada del trombo está determinado por el postanálisis a través de la tinción de inmunofluorescencia de moléculas específicas.
Los resultados representativos describen la configuración experimental, la recopilación de datos y el análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada sección se pueden ajustar incluyendo el tipo de célula, las tasas de cizallamiento, la geometría del canal, la terapia farmacológica y los procedimientos de postanálisis. El protocolo se valida cuantificando la formación de trombos en el endotelio de la arteria pulmonar de pacientes con enfermedad tromboembólica crónica.

Los resultados representativos se pueden dividir en tres partes, cada una de las cuales representa los pasos respectivos de configuración experimental, recopilación de datos y análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada paso se pueden cambiar. Los datos presentados se aplican para estudiar la influencia del endotelio en la formación de trombos.
Configuración experimental Está bien establecido que las células endoteliales son altamente heterogéneas en estructura y función, dependiendo de la ubicación y el tiempo, durante la salud y la enfermedad23. Varias fuentes de células endoteliales se pueden utilizar para estudiar la interacción endotelial-sangre, que en este caso eran HUVECs y PAEC disponibles comercialmente (Figura 1A). Los HUVEC han sido los más utilizados en modelos de laboratorio, mientras que los PAEC son células aisladas derivadas del paciente de las arterias pulmonares. Además, existen protocolos bien establecidos para aislar las células endoteliales microvasculares (MVEC) de la circulación pulmonar o de las células formadoras de colonias endoteliales circulantes de sangre (ECFC)25,,28,,29.
Después del aislamiento, las células endoteliales se caracterizaron por la tinción de VE-cadherina, CD31 y TIE2 para confirmar un fenotipo endotelial. La caracterización de la presencia de la SMA y la citoqueracina indicaba la ausencia de un fibroblasto o fenotipo similar a un epitelial(Figura 1B). Después de obtener una población altamente pura de ECs, se utilizaron células de paso 3-5 para sembrar un microdeslizo comercial o canales de flujo microfluídicos hechos a medida (Figura 1C). Mientras que los microdeslizos disponibles comercialmente son principalmente cámaras de flujo paralelas, o canales en forma de Y con parámetros definidos específicamente en altura o ángulo de bifurcación, el uso de diapositivas microfluídicas permite adaptar los parámetros experimentales a la geometría del vaso in vivo y la dinámica del flujo sanguíneo31. Sin embargo, los tamaños microfluídicos hechos a medida son más pequeños y tienden a limitar la propagación celular e inducir más muerte celular32,,33. El uso de un excedente de células compensa el hecho de que sólo un pequeño porcentaje de células se adhieren. Esto se observó cuando se introdujo una estenosis, donde las células endoteliales mostraron un fenotipo más alargado en comparación con un canal microfluídico paralelo(Figura 1D). Las cámaras de flujo comercial tienen un área de superficie más grande a la que las células pueden unirse. Esto requiere menos números de celda para la siembra.
Para estudiar la interacción endotelial de células celulares y sangre, toda la sangre se perfundió sobre una monocapa endotelial. La sangre citrated se recogió el día del experimento e inmediatamente antes de la perfusión recalificada. Las células fueron estimuladas con histamina para inducir la liberación de VWF y la adhesión plaquetaria 30 min antes de la perfusión (Figura 1E)34,35. Debido a las pequeñas dimensiones, los canales microfluídicos hechos a medida permitieron el uso de volúmenes sanguíneos más pequeños.
Recopilación de datos Para investigar la formación de trombos en los PAEC, los glóbulos con etiqueta fluorescente Calcein AM-Red y la fibrina conjugada Alexa488 se perfundieron durante 5 minutos a 2,5 dyne/cm2 (Figura 2A–C). Se cuantificaron las células sanguíneas adherentes y la fibrina depositada. Las imágenes se adquirieron cada 30 s y se cuantificaron con ImageJ. Era importante restar el fondo para eliminar la autofluorescencia de las plaquetas no adheridas. El algoritmo de triángulo para el umbral se ha utilizado para definir un fondo mínimo. Permitió la medición de pequeños agregados plaquetario(Figura 2D).
Se espera que, en condiciones no estimuladas, no hubo unión de plaquetas y fibrina al endotelio. Para promover la liberación de VWF y la unión plaquetaria, los PAEC fueron estimulados con histamina, lo que resultó en un aumento inmediato de la adhesión plaquetaria alcanzando una meseta después de 2,5 min. En este momento, las plaquetas comenzaron a secretar factores autocrinos que indujeron la agregación plaquetaria y la escisión de fibrinógeno en fibrina. La fibrina se depositó después de 3 min y formó un agregado estable con plaquetas después de 4 min(Figura 2E).
Para investigar si este efecto podría ser inhibido por un anticoagulante oral directo (DOAC), la sangre fue tratada con 10 nM dabigatran. Dabigatrán se añadió a la dilución de la sangre, donde inhibe el factor IIa en la vía de coagulación, y previno el escisión de fibrinógeno para formar fibras de fibrina. Cuando la sangre tratada con dabigatrán se perfundió sobre los PAC estimulados, la formación de coágulos podría inhibirse directamente principalmente retrasando la deposición de fibrina (Figura 2F).
Análisis de datos Para estudiar la influencia de varias fuentes endoteliales en la formación de trombos, se analizaron los cambios celulares a 5 min de perfusión sanguínea. El endotelio se fijó y las plaquetas adherentes se etiquetaron con CD42b antes de la toma de imágenes bajo un microscopio confocal. Esto proporcionó un análisis detallado para la colocación de plaquetas y fibrina que podría indicar factores de coagulación disfuncionales en la sangre. La influencia de la EC en la formación de coágulos se determinó mediante tinción inmunofluorescente estándar. Se mantuvieron los contactos de células celulares endoteliales, como lo confirmó la tinción de VE-cadherina, lo que indica que los coágulos sanguíneos se formaron en la parte superior de la monocapa endotelial en lugar de en la matriz subyacente entre las brechas endoteliales (Figura 3). Además, el uso de diferentes fuentes celulares dio lugar a diferentes patrones de trombos que se forman en el endotelio. Los HUVEC son células endoteliales venosas y mostraron una adhesión plaquetaria limitada y una deposición de fibrina, mientras que los pacientes enfermos de PAEC primario de CTEPH mostraron una abundante adherencia plaquetaria y más deposición de fibrina en la estimulación de la histamina en comparación con el PAEC sano. Esto sugiere que el endotelio de los pacientes con TEPH muestra una mayor capacidad de respuesta a la vasoactivación que resulta en un aumento de la formación de trombos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Figura 1: Descripción general esquemática del protocolo. (A) Varias fuentes y diferentes tipos de células endoteliales se aislaron y cultivaron para su uso en un canal de flujo microfluídico para experimentos de perfusión. Imágenes representativas de campo brillante de diferentes tipos de células endoteliales. Barra de escala a 50 m. (B) Las células aisladas se caracterizaron por tinción inmunofluorescente para confirmar un fenotipo endotelial. Barra de escala a 50 m. (C) Las celdas se pueden sembrar en diapositivas de flujo comercial o en canal microfluídico hecho a medida. (D) Imágenes representativas de campo brillante de HUVEC cultivadas en diferentes geometrías de canal. Barra de escala a 50 m. (E) Configuración experimental de experimentos de perfusión sanguínea. Se recogió sangre citrated, se diluyó con tampón salino y se perfundió sobre las células endoteliales con una bomba de jeringa. La vena pulmonar y umbilical de esta figura fueron modificadas de Servier Medical Art, licenciada bajo una Licencia Genérica Creative Common Attribution 3.0. http://smart.servier.com/ Haga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Figura 2: Adquisición de imágenes y cuantificación de la formación de trombos. (A) Imágenes representativas de lapso de tiempo de las plaquetas adelantadas con etiquetas Calcein AM-Red y fibrina conjugada Alexa488 a 1, 3 y 5 min después de la perfusión de sangre entera sobre LOS PAEC no estimulados (B) y sobre las PAC estimuladas por histamina. (C) Imágenes representativas de lapso de tiempo de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina a 1, 3 y 5 minutos de perfusión con sangre entera incubada con dabigatrán perfundido sobre LOS PAEC estimulados por histamina. Barra de escala a 50 m. (D) Visión general esquemática de la cuantificación de imágenes en ImageJ. (E) Cuantificación de la adhesión plaquetaria y deposición de fibrina por cada 30 s en un endotelio estimulado por histamina no estimulada. (F) Cuantificación del efecto del dabigatrán en la formación de trombos cuantificado por adhesión plaquetaria y deposición de fibrina. Los datos se representan como ± SD, n a 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Figura 3: Imágenes confocales representativas de experimentos de flujo para caracterizar la formación de trombos en la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina en células endoteliales. Los contactos de células celulares endoteliales se caracterizaron por VE-cadherina y se midieron en PAEC de control, PAC CTEPH derivados del paciente y HUVEC. Barra de escala a 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Este modelo de enfermedad in vitro, se puede utilizar para estudiar la interacción de la sangre entera y las células derivadas del paciente, específicamente el endotelial, para evaluar la trombogenicidad y la eficacia de los agentes anticoagulantes. Esto es células de endotelio se puede utilizar en varias circunstancias y se puede modificar mediante la introducción de microfluídicos hechos a medida o mediante el ajuste de los parámetros de flujo sanguíneo. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar la dinámica del trombo en condiciones inflamatorias, o para evaluar los efectos de la terapia anticoagulante y antiagregante plaqueta.En última instancia, estos enfoques se pueden utilizar en un método de medicina personalizada. Después de obtener una muestra quirúrgica de tejido de la arteria pulmonar humana, recubre la antena para unión celular de alta afinidad a 60 mililitros con dos mililitros de cinco microgramos por mililitro de fiboronectina e incuba el plato a 37 grados centígrados durante al menos 15 minutos. Al final de la incubación, utilice fórceps estériles en un armario de flujo laminar en condiciones estériles, para transferir el tejido a un plato Petri de PBS.Si el tejido todavía está en un anillo, corte la arteria abierta con tijeras, teniendo cuidado de no tocar la capa más interna del vaso, ya que el endotelio se daña y se retira fácilmente. Después de extraer la fibronectina, añadir cuatro mililitros de medio de célula endotelial completo al plato y utilizar fórceps para transferir la muestra de tejido en el medio, utilizar un bisturí para raspar cuidadosamente la capa interna del vaso en el medio, teniendo cuidado de evitar cualquier acumulación de lípidos que se observen en la pared del vaso. Después de que las células hayan sido cosechadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular.Si los fibroblastos contaminan el cultivo, utilice la separación de células de afinidad magnética para un CD144, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para purificar las células. Generalmente, el cultivo se define como puro, cuando la citometría de flujo detecta un 10% o menos de células contaminantes. Cuando se ha obtenido el número suficiente de células endoteliales para uso experimental, las células endoteliales primarias se pueden caracterizar por la presencia de marcadores específicos de células endoteliales y por la ausencia de marcadores musculares lisos y de células epiteliales.Para la preparación de la cámara de flujo, codifique un canal de un portaobjetos de seis pozos con 30 microlitros de 0,1% de gelatina e incubar este portaobjetos durante al menos 15 minutos a 37 grados centígrados. Además de las cámaras de flujo comerciales, se pueden utilizar cámaras de flujo hechas a medida con dimensiones específicas para estudiar la influencia de la geometría vascular en la dinámica de los coágulos. Mientras la diapositiva está incubando, recoger las células de un cultivo celular endotelial de la arteria pulmonar confluente con EDTA y tripina y sedimento que las células por centrifugación, volver a suspender el pellet en 600 microlitros de medio celular endotelial completo y con fuerza pero suavemente, añadir 100 microlitros de células en cada canal, añadir 50 microlitros adicionales de medio de células endoteliales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal , para proporcionar un medio suficiente para la incubación durante la noche a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono, cambie el medio al día siguiente para lavar las células no unidas.Después de seis días en el cultivo, las células deberían haber formado una monocapa confluente estable. En el séptimo día del cultivo de células endoteliales de la arteria pulmonar, adquiera muestras de sangre venosa de sujetos que no reciban tratamiento de anticoagulación en 109 tubos anticoagulantes de citrato monosódico y transfiera la sangre a un tubo de 50 mililitros. La sangre puede contener virus y otros agentes infecciosos.Por lo tanto, es importante usar siempre guantes y seguir las instrucciones de seguridad para trabajar con material humano. Fluorescentemente etiquetaron las células sanguíneas con 1 a 10.000 concentración de Calcein AM Red y 50 microgramos por mililitro y añadimos Alexa 488 fibrinógeno, luego incubar la sangre a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir una absorción completa. 30 minutos antes de la perfusión, tratar las células endoteliales de la arteria pulmonar con 100 microlitros de una histamina micromolar en medio de células endoteliales y 1%suero bovino fetal sin ningún otro aditivo.Y utilice una jeringa de 20 mililitros llena de tampón de lavado para enjuagar los tubos del sistema de flujo, cargue una jeringa de tercero a 20 mililitros con dos mililitros de tampón de lavado y cargue la jeringa en una bomba de jeringa. Utilice una segunda jeringa de 20 mililitros para llenar los tubos de flujo con hippies más tampón que contenga albúmina sérica 1%bovina y utilice un conector Laura en forma de codo para conectar cuidadosamente los tubos a la micro diapositiva, conectar la salida de la diapositiva a la jeringa, reparar desde la microscopía colocando la célula que contiene la diapositiva en el escenario y ensamblar la configuración para el experimento , ajuste el microscopio y establezca los parámetros para la toma de imágenes. Recalcificación de sangre enfática.Y este es un feliz copatrocinador de la coagulación, además tratar de evitar la formación de burbujas de aire porque esto dañará la capa celular endotelial e influirá en sus resultados. Inmediatamente antes de la perfusión, diluir la sangre dos veces con tampón de recalcificación y colocar el tubo de entrada del microobjeto en el tubo de sangre, pulse start en la bomba de la jeringa. Tan pronto como la sangre comience a fluir sobre el endotelio, presione start en el microscopio para adquirir imágenes utilizando los canales activos preseleccionados y la región de las posiciones de interés, cada 15 segundos durante cinco minutos.Al final del análisis, detenga la grabación y la bomba de la jeringa y limpie correctamente. El etiquetado de plaquetas con Calcein AM Red y la adición de Fibrinógeno conjugado Alexa 488, permite la investigación de la formación de trombos por adhesión plaquetaria y fibra y deposición. En condiciones no estimuladas, no hay unión de plaquetas o fibrina al endotelio.La estimulación con histamina resulta en un aumento inmediato en la adhesión plaquetaria, que alcanza una meseta después de 2,5 minutos, en este momento, las plaquetas comienzan a secretar factores autocrinos que inducen una agregación plaquetaria y escisión de fibrinógeno a fibrina, lo que resulta en fibra y deposición a los tres minutos y la formación de un agregado estable con las plaquetas después de cuatro minutos. El tratamiento con un anticoagulante directo, inhibe tanto la formación de coágulos como la adhesión plaquetaria en comparación con la sangre no tratada. El análisis inmunofluorescente de las interacciones plaquetarias de células endoteliales de la arteria pulmonar después de cinco minutos de perfusión, revela el mantenimiento de la célula endotelial, contactos celulares, como lo confirma la tinción de cadherina endotelial vascular, lo que indica que los coágulos sanguíneos se forman en las capas del modelo endotelial en lugar de en la matriz subyacente entre las brechas endoteliales.las células endoteliales de venas umbilicales humanas demuestran menos adherencia plaquetaria y deposición de fibrina en comparación con el endotelio de la arteria pulmonar. En particular, las células endoteliales de la arteria pulmonar primaria enfermas de pacientes con hipertensión pulmonar tromboembólica crónica, presentan un aumento de la adherencia plaquetaria y más deposición de fibrina en comparación con las células sanas. La trombogenicidad del endotelio depende de múltiples factores como el origen del lecho vascular o las partes de fondo biológico.Usando este protocolo, las disfunciones intrínsecas en los componentes vasculares y sanguíneos, así como la eficacia de la terapia anticoagulante se pueden probar durante diferentes fases de la trombosis hemostasia. Este protocolo se puede utilizar para comprender las interacciones sanguíneas y Teo, en diversas enfermedades tromboembólicas con el potencial final para predecir respuestas específicas del paciente a la terapia de anticoagulación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigación

Inmunología e Infección

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During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

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Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

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Una Novela<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

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In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

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