Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Dette arbejde modtog støtte fra DEN Europæiske Unions HORIZON 2020-program for forskning, teknologisk udvikling og demonstration i henhold til tilskudsaftale nr. Vi takker Dr. Ana Costa og Dr. Jenny Juntke for den store støtte til udviklingen af co-kultur, Olga Hartwig, for den videnskabelige illustration, Anja Honecker, for ELISA assays, Petra König, Jana Westhues og Dr. Chiara De Rossi for støtte til cellekultur, analyse og mikroskopi. Vi takker også Chelsea Thorn for korrekturlæsning af vores manuskript.

1. Vækst og differentiering af celler i gennemtrængelige støtte skær
<ol><li>Dyrk CFBE41o- i en T75 kolbe med 13 ml minimumstingentielt medium (MEM), der indeholder 10% føtal kalveserum (FCS), 1% ikke-essentielle aminosyrer og 600 mg/L-glucose ved 37 °C med 5 % CO2-atmosfære. Tilføj frisk medium til cellerne hver 2-3 dage.<ol>
<li>Aflad cellerne efter at have nået 70% sammenløb i kolben med 3 ml trypsin- Ethylenediamintetraaceticsyre (EDTA) ved 37°C i 15 min. Der tilsættes 7 ml frisk M...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+and+host+immunity+to+infection.">Lung dendritic cells and host immunity to infection.</a> European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).</li><li>Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. A., Schulze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+Vaccine+Adjuvant+System+Alum/c-di-AMP+Results+in+Quantitative+and+Qualitative+Enhanced+Immune+Responses+Post+Immunization.">The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).</li><li>Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+selective+autophagy-induction+rescues+&#948;F508-CFTR+and+inhibits+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+cystic+fibrosis.">Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues &#948;F508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis.</a> PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).</li><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Dette papir beskriver en protokol for en 3D co-kultur af de inficerede luftveje, der udgøres af den menneskelige cystisk fibrose bronkial epitelcellelinje CFBE41o- og den menneskelige monocyt-afledte makrofag cellelinje THP-1. Protokollen gør det muligt at vurdere epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakterier overlevelse, og betændelse, som er vigtige parametre, når test af lægemidlets effektivitet og vært-respons samtidig. Det nye i modellen ligger i inkorporering af epitelceller (dvs. human CF cel...

Pseudomonas aeruginosa er et relevant patogen i cystisk fibrose (CF), der bidrager til nedsat lungevæv1. Produktionen af polysaccharider, såsom alginat og andre mucoid exopolysaccharider, koordinerer udviklingen af sygdommen, hvilket fører til ihærdig bakteriel overholdelse, begrænser leveringen af antibiotika til bakterier og beskytter bakterier mod værtens immunsystem2. Overgangen af P. aeruginosa fra planktonstadiet til biofilmdannelse er et kritisk spørgsmål i denne sammenhæng, hvilket også letter forekomsten af antibiotikatolerance.
I forbindelse med CF er musen primært blevet brugt som model. Mus, dog, ikke spontant udvikle denne sygdom med indførelsen af CF mutationer3. De fleste af de bakterielle biofilm udvikling og narkotika modtagelighed undersøgelser er blevet udført på abiotiske overflader, såsom petriskåle. Denne fremgangsmåde repræsenterer imidlertid ikke kompleksiteten. For eksempel er vigtige biologiske barrierer fraværende, herunder immunceller samt slimhindepitel. Selvom P. aeruginosa er ganske giftigt for epitelceller, har nogle grupper formået at co-dyrke en tidligere P. aeruginosa biofilm med menneskelige bronkiale celler. Disse celler stammer fra patienter med cystisk fibrose med CFTR-mutation (CFBE41o- celler)4 og fik lov til at vurdere antibiotiskeffekt 5 eller vurdere korrektionen af CFTR-proteinet underinfektion 6. En sådan model viste sig at forbedre forudsigeligheden af lægemidlets effektivitet, ud over at muliggøre karakterisering af problemer med lægemidler, der mislykkedes i senere faser af udviklingen af lægemidler7.
Men i lungerne, slimhinde epitel er udsat for luft. Desuden spiller immunceller, der findes i luftvejene, ligesom vævsmakrofager, en afgørende rolle mod inhalerede patogener eller partikler8. Makrofager migrere gennem de forskellige cellelag for at nå bronkial lumen og bekæmpe infektionen. Desuden, inhalerede lægemidler også nødt til at klare tilstedeværelsen af slim som en yderligere ikke-cellulære element i lungeluftblod barriere9. Faktisk er der udviklet flere komplekse tredimensionale in vitro-modeller med det formål at øge in vivo-relevansen. Co-kultur systemer ikke kun øge kompleksiteten af in vitro-systemer til opdagelse af lægemidler, men også gøre det muligt at studere celle-celle interaktioner. En sådan kompleksitet er blevet behandlet i undersøgelser om makrofag migration10, frigivelse af antimikrobielle peptider af neutrofiler11, den rolle, slimi infektion 9, og epitelcellereaktion på overdreven skade12. Men en pålidelig CF-inficeret in vitro-model, der er udstyret med den genetiske mutation i CF, der er udsat for luften (øget fysiologisk tilstand), og integrerer immunceller mangler stadig.
For at bygge bro over denne kløft beskriver vi en protokol for stabile menneskelige 3D-samkulturer i de inficerede luftveje. Modellen består af humane CF bronkiale epitelceller og makrofager, inficeret med P. aeruginosa og i stand til at repræsentere både en diffusional og immunologisk barriere. Med det mål at teste anti-infektiøs på rimeligt høj gennemløb, blev denne co-kultur etableret på den gennemtrængelige filtermembran af godt plade skær, ved hjælp af to menneskelige cellelinjer: CFBE41o- og THP-1 monocyt-afledte makrofager. Desuden, til sidst at studere deposition af aerosoliserede anti-infektiøs13, modellen blev etableret på luft-væske interface (ALI) snarere end flydende dækket betingelser (LCC).
Som vi rapporterer her, denne model giver mulighed for at vurdere ikke kun bakteriel overlevelse på en antibiotikabehandling, men også celle cytotoksicitet, epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, og inflammatoriske reaktioner, som er væsentlige parametre for udviklingen af lægemidler.
Denne protokol kombinerer to relevante celletyper til inhalationsbehandling af lungeluftvejene: makrofager og CF bronkial epitel. Disse celler er seedet på modsatte sider af gennemtrængelige støtte skær, så celle eksponering for luft (kaldet luft-væske interface (ALI) betingelser). Denne samkultur af værtsceller er efterfølgende inficeret med P. aeruginosa. Begge værtscellelinjer er af menneskelig oprindelse: Epitelcellerne repræsenterer cystisk fibrose bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o-), og THP-114 celler er en vel karakteriseret makrofag-lignende cellelinje. Et sammenløb epitellag er først tilladt at danne på oversiden af godt plade skær før makrofag-lignende celler er føjet til det modsatte rum. Når co-kulturen er etableret på ALI, er systemet podet med P. aeruginosa på den apikale side. Dette inficerede samkultursystem anvendes derefter til at vurdere effekten af et antibiotikum, f.eks. Følgende endepunkter analyseres: epitelbarriereintegritet i form af transepithelial elektrisk modstand (TEER), visualisering af cellecelle- og cellebakterier ved konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM), bakteriel overlevelse ved optælling af kolonidannende enheder (CFU), værtscelleoverlevelse (cytotoksicitet) og cytokinfrigivelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

fDrug forskning til behandling af lungeinfektioner skrider frem i retning af prædiktive in vitro modeller af høj kompleksitet. Den mangesidede tilstedeværelse af bakterier i lungemodeller kan re-tilpasse epitel arrangement, mens immunceller koordinere en inflammatorisk reaktion mod bakterier i mikromiljø. Mens in vivo modeller har været valget til at teste nye anti-infektiøse i forbindelse med cystisk fibrose, de stadig ikke præcist efterligne in vivo betingelser for sådanne sygdomme hos mennesker og behandlingsresultater. Komplekse in vitro-modeller af de inficerede luftveje baseret på humane celler (bronkiale epitel og makrofager) og relevante patogener kunne bygge bro over dette hul og lette oversættelsen af nye anti-infektiøs i klinikken. Til sådanne formål, en co-kultur model af den menneskelige cystisk fibrose bronkiale epitelcelle linje CFBE41o- og THP-1 monocyt-afledte makrofager er blevet etableret, efterligne en infektion af den menneskelige bronkiale slimhinde ved P. aeruginosa på luft-væske interface (ALI) betingelser. Denne model er sat op i syv dage, og følgende parametre er samtidig vurderet: epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakteriel overlevelse, og inflammation. Denne protokol beskriver et robust og reproducerbart system til evaluering af lægemiddeleffektivitet og værtsresponser, der kan være relevante for at opdage nye anti-infektiøsstoffer og optimere deres aerosollevering til lungerne.

Figur 1A viser morfologien af den resulterende samkultur af menneskelige bronkiale epitelceller og makrofager efter dyrkning både i 24 timer på den apikale og basolaterale side af gennemtrængelige understøtninger, henholdsvis. Epitelbarrierens integritet vises ved højere TEER (834 Ω×cm2) og CLSM ved immunstaining for det stramme krydsprotein ZO-1 (Figur 1B). De samme resultater observeret med hensyn til barriere integritet ikke-inficerede CFBE4...

Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Vi beskriver en protokol for en tre-dimensionel co-kultur model af inficerede luftveje, ved hjælp af CFBE41o- celler, THP-1 makrofager, og Pseudomonas aeruginosa, etableret på luft-væske interface. Denne model giver en ny platform til samtidig at teste antibiotika effekt, epitelbarriere funktion, og inflammatoriske markører.

P. aeruginosa Inficeret 3D Co-Kultur af bronkial epitelceller og makrofager på Air-Liquid Interface for præklinisk evaluering af anti-infektiøs

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Så når vi evaluerer nye anti-infektiøs, er vi nødt til at tage fat på to ting. Den ene side er bakterierne. Hvis de er planktoniske eller informeret biofilm, den anden side er tilstedeværelsen af værtsceller, især epitel værtsceller, som danner stramme biologiske barrierer.Hvis disse barrierer foretages, hvordan den monologiske reaktion kan være, og med denne nye model, kan vi faktisk overvåge begge parametre på samme tid. Ved behandling af bakterielle infektioner, vi er nødt til at indse, hvad organ er berørt. For eksempel, hvis det er lungen, vi kan drage fordel, og topisk administrere stoffet som en aerosol.Men hvis vi ønsker en model til at studere dette, har vi brug for en model, der også tillader aerosoler, hvilket er tilfældet i vores model. Den anden fordel er, at det er baseret på menneskelige celler, så vi kan undgå problemer på grund af forskelle i forhold til dyr og arter forskelle. Dette system kan give dig mere indsigt i området for infektion forskning ved at kaste lys over molekylære og cellulære begivenheder under samspillet mellem værtsceller og bakterier.Når du forsøger denne protokol for første gang, skal du huske at kontrollere cellemediet for sterilitet og cellemorfologi og være forsigtig, når du håndterer de gennemtrængelige understøtninger. Dyrk CFBE41 O minus celler i en T 75 kolbe med minimum væsentlige medium, der indeholder 10% FCS, 1% ikke-essentielle aminosyrer, og 600 milligram per liter glukose ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Tilføj frisk medium til cellerne hver to til tre dage.Efter cellerne nåede 70% sammenløb, vaske dem med 10 milliliter PBS og afmontere med tre milliliter trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Derefter tilsættes syv milliliter frisk MEM og centrifuge cellerne ved 300 gange G i fire minutter. Efter udsmid af supernatant, ved 10 milliliter MEM, mens klumper med blid pipettering.Tæl cellerne med en automatiseret celletæller eller Hemocytometerkammer, og fortynde dem derefter til en koncentration på 200.000 celler pr. 500 mikroliter til såning i 12 brøndplader med gennemtrængelige understøtninger. Tilsæt 500 mikroliter af cellesuspensionen pr. brønd til den apikale side af den gennemtrængelige støtte. Derefter tilsættes 1,5 milliliter frisk medium til den basale laterale side.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 72 timer. På den tredje dag efter såning, skabe en luft væske interface ved at fjerne mediet fra den basale laterale side først derefter fra den apikale side. Tilsæt 500 mikroliter frisk MEM til den basale laterale side og skift mediet hver anden dag, indtil cellerne danner et sammenflydende monolag.For at vurdere cellernes epitelbarriereegenskaber tilsættes 500 mikroliter cellemedium til den apikale side og 1,5 milliliter til den basale laterale side, hvortil pladen blev returneret til inkubatoren i en time. Mål transitmaterialet elektrisk modstand eller TEER med ann STX2 spisepinde elektrode og en epitel volt ohm meter. At dyrke THP1 celler, dyrke dem i T 75 kolbe ved hjælp af RPMI 1640 medium, suppleret med 10% FCS på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Opdel cellerne hver anden dag ved at så 2 millioner celler pr. milliliter i en ny T75-kolbe. For at differentiere THP1 cellerne, centrifuge indholdet af kolben ved 300 gange G i fire minutter, kassér supernatant. Opsprænning af pellet i frisk medium og sat i en ny T75 kolbe.Tilsæt 10 nanogram pr. milliliter PMA til cellerne og returnere dem til kuvøsen. At løsne makrofag som celler, vaske dem én gang med PBS ved 37 grader Celsius, og inkubere dem med tre milliliter celleløsning, der indeholder 0,5 millimolar EDTA i 10 minutter ved stuetemperatur. Kontroller for celledesachment under et omvendt mikroskop.Når cellerne er afmonteret, tilsættes syv milliliter frisk medium og centrifuge dem ved 300 gange G i fire minutter. Efter fjernelse af supernatanten, resuspenderede makrofagceller i tre milliliter THP1 medium i en 15 milliliter konisk rør, tælle cellerne, og inkubere dem i højst en time før opsætning af co-kultur. For at etablere en epitel makrofag co-kultur, skal du fjerne mediet fra det nederste kammer af CFBE41 O minus monolag og omhyggeligt vende støtten inde i et sterilt glas Petriskål, skal du bruge en celle skraber til at fjerne cellerne tilgroet gennem membranen porer.Placer 200, 000 THP1 makrofager i 200 mikroliter af RPMI på den basale laterale side af den omvendte indsætte i hver brønd, lukke petriskåle, og inkubere dem i to timer. Derefter placeres indsatsen tilbage i de 12 brøndmikroplader og tilsæt 500 mikroliter MEM-medium til den basale laterale side af den gennemtrængelige indsats. Inoculate 15 milliliter lb suppleret med 300 mikrogram pr. milliliter ampicillin med en enkelt koloni af P aeruginosa, PAO1GFP, inkubere bakterierne i 18 timer ved 37 grader Celsius, mens ryste ved 180 RPM.Efter inkubationen overføres bakterierne til et konisk rør på 50 milliliter og centrifuger ved 3,850 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt 10 milliliter steril PBS, der er blevet forvarmet til 37 grader Celsius. Optiske densitet ved 600 nanometer måles, og bakteriekoncentrationen med cellekulturmediet måles til en endelig koncentration på 200.000 kolonidannende enheder pr. milliliter, hvilket svarer til en mangfoldighed af infektion af en bakterie pr. epitelcelle.Tilsæt 100 mikroliter bakteriel suspension til den apikale side af den gennemtrængelige støtte og inkubere pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en time for at tillade bakterier at knytte til cellerne, derefter forsigtigt fjerne apical væske med en pipette til at genoprette ALI betingelser. For eksperimenter med narkotikabehandling, tilsæt 500 mikroliter af et lægemiddel løsning fortyndet i celle medium til den apikale side. Derefter tilsættes 1,5 milliliter cellemedium til den basale laterale side.Saml 500 mikroliter af det atypiske og basale laterale medium og pool dem for at vurdere CFU af løsgængere bakterier. For at vurdere overlevelsen af påsatte eller internaliserede bakterier, tilsættes 500 mikroliter sterilt deioniseret koldt vand til hvert rum i den gennemtrængelige støtte, og inkubere cellerne i 30 minutter ved stuetemperatur. Hvis CFU vurderes fra frosne prøver, skal du tø dem op ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Brug derefter pipettespidser til at skrabe membranens overflade, idet du skal passe på ikke at lægge for meget pres på brøndene. Pipette op og ned for at fjerne alt klæbet indhold. Med bakteriel suspension fra begge fraktioner, lave en en til 10 seriel fortynding med PBS tween og plade bakterierne på lb agar plader.Inkuber agarpladerne ved 30 grader Celsius i 16 til 72 timer, og tæl derefter kolonierne og beregn CFU. Morfologien af den resulterende co-kultur af menneskelige bronkiale epitelceller og makrofager på den apiske og basilikum laterale side af gennemtrængelige støtter er vist her. En højere TEER måling og immunstaining for den stramme krydset proteiner ZO1, viste epitelbarriere integritet.For at modellere en bakteriel infektion blev P aeruginosa podet på CFBE41 o minusceller. Makrofager blev observeret på den apikale side af co-kultur seks timer efter infektion. TEER faldt til 250 ohm per centimeter kvadreret, hvilket indikerer en kompromitteret epitelbarriere, som også blev foreslået af ZO1 farvning.Makrofag trans migration gennem gennemtrængelige filter porer og bakterier optagelse af THP-1 celler på den apikale side er vist her. I THP-1 monokulturer, makrofag migration så tidligt som en time efter infektion. I mellemtiden migration blev set efter tre timer efter infektion i co-kultur.Inficerede co-kulturer behandlet med tobramycin i seks eller 20 timer blev afbildet med konfokal scanning lasermikroskopi. Uden behandling døde enten epitelcellerne eller makrofagerne efter 20 timers infektion. På trods af at blive set efter seks timers behandling i mikroskopi billeder, en CFU assay viste, at bakterierne ikke formere sig.Ikke desto mindre, bakterierne genvundet deres spredning kapacitet efter 20 timers behandling. Teer af monokulturer og samkulturer blev også målt. CO-kulturen i CFBE41 o minus celler med THP-1 ikke fremkalde nogen ændringer i epitelbarriere integritet i forhold til monokultur.Ved infektion faldt TEER-værdien. Når du udfører denne procedure, er det afgørende at sikre, at cellerne sidder korrekt, og at filtermembranen ikke forstyrres. Derfor skal cellesåningstrinnene udføres omhyggeligt.Ud over denne protokol, nebulization af antibiotika på skær ville gøre det muligt at se, om bakterier overlevelse ændringer i forhold til neddykkede betingelser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Bestemmelse af tolerabel fedtsyrer og koleratoxin Koncentrationer anvendelse af humant tarmepitelceller og BALB / c musemakrofager

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering af humanmonocytter af Double Gradient centrifugering og deres differentiering til makrofager i teflonbelagte Cell Culture Tasker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering bakteriel invasion af hjerteceller i kultur og hjerte kolonisering i inficerede mus ved hjælp af Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput kvantitativ real-time RT-PCR assay til bestemmelse Expression Profiler af type I og III Interferon Undertyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...