Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Dit werk ontving financiering van het HORIZON 2020-programma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie in het kader van subsidieovereenkomst nr. Wij danken Dr. Ana Costa en Dr. Jenny Juntke voor de grote steun aan de ontwikkeling van de co-cultuur, Olga Hartwig, voor de wetenschappelijke illustratie, Anja Honecker, voor ELISA-tests, Petra König, Jana Westhues en Dr. Chiara De Rossi voor de ondersteuning van celcultuur, analyse en microscopie. We danken Ook Chelsea Thorn voor het nalezen van ons manuscript.

1. Groei en differentiatie van cellen in doorlaatbare steunwisselplaten
<ol><li>Cultiveren CFBE41o- in een T75-kolf met 13 mL minimaal essentieel medium (MEM) met 10% foetale kalfsserum (FCS), 1% niet-essentiële aminozuren en 600 mg/L glucose bij 37 °C met 5 % CO2-atmosfeer. Voeg elke 2-3 dagen vers medium toe aan de cellen.<ol>
<li>Maak de cellen na het bereiken van 70% samenvloeiing in de kolf los met 3 mL trypsine- Ethyleenediaminetetraacetic zuur (EDTA) bij 37°C gedurende 15 minuten. Voeg 7...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+and+host+immunity+to+infection.">Lung dendritic cells and host immunity to infection.</a> European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).</li><li>Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. A., Schulze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+Vaccine+Adjuvant+System+Alum/c-di-AMP+Results+in+Quantitative+and+Qualitative+Enhanced+Immune+Responses+Post+Immunization.">The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).</li><li>Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+selective+autophagy-induction+rescues+&#948;F508-CFTR+and+inhibits+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+cystic+fibrosis.">Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues &#948;F508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis.</a> PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).</li><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Dit document beschrijft een protocol voor een 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen, gevormd door de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o- en de menselijke monocyten-afgeleide macrofaag cellijn THP-1. Het protocol maakt de beoordeling van epitheliale barrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriën overleving, en ontsteking, die belangrijke parameters bij het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en gastheer-reacties tegelijkertijd. De nieuwigheid in het model ligt in...

Pseudomonas aeruginosa is een relevante ziekteverwekker bij cystische fibrose (CF) die bijdraagt aan longweefselstoornissen1. De productie van polysaccharides, zoals alginaat en andere mucoid exopolysadiaden, coördineert de voortgang van de ziekte, wat leidt tot hardnekkige bacteriële therapietrouw, beperkt de levering van antibiotica aan bacteriën en beschermt de bacteriën tegen het immuunsysteem van de gastheer2. De overgang van P. aeruginosa van het planktonische stadium naar biofilmvorming is in deze context een kritiek punt, waardoor ook het optreden van antibioticatolerantie wordt vergemakkelijkt.
In het kader van CF is de muis voornamelijk als model gebruikt. Muizen ontwikkelen deze ziekte echter niet spontaan met de introductie van CF-mutaties3. De meeste van de bacteriële biofilm ontwikkeling en drug gevoeligheid studies zijn uitgevoerd op abiotische oppervlakken, zoals petrischaaltjes. Deze benadering vertegenwoordigt echter niet de complexiteit in vivo. Zo ontbreken belangrijke biologische barrières, waaronder immuuncellen en het mucosale epitheel. Hoewel P. aeruginosa is vrij giftig voor epitheliale cellen, sommige groepen zijn erin geslaagd om co-cultiveren een eerdere P. aeruginosa biofilm met menselijke bronchiale cellen. Deze cellen zijn afkomstig van patiënten met cystische fibrose met CFTR-mutatie (CFBE41o- cellen)4 en konden de werkzaamheid van antibioticabeoordelen 5 of de correctie van het CFTR-eiwit tijdens infectie beoordelen6. Een dergelijk model bleek de voorspelbaarheid van de werkzaamheid van geneesmiddelen te verbeteren, naast het mogelijk maken van karakterisering van problemen met geneesmiddelen die faalden in latere fasen van de ontwikkeling van geneesmiddelen7.
Echter, in de long, het mucosale epitheel wordt blootgesteld aan lucht. Bovendien spelen immuuncellen die in de luchtwegen aanwezig zijn, zoals weefselmacrofagen, een essentiële rol tegen ingeademde ziekteverwekkers of deeltjes8. Macrofagen migreren door de verschillende cellagen om het bronchiale lumen te bereiken en de infectie te bestrijden. Bovendien hebben ingeademde geneesmiddelen ook te maken met de aanwezigheid van slijm als een extra niet-cellulair element van de longluchtbloedbarrière9. Er zijn inderdaad verschillende complexe driedimensionale (3D) in vitro modellen ontwikkeld, gericht op het vergroten van de in vivo relevantie. Co-cultuur systemen verhogen niet alleen de complexiteit van in vitro systemen voor het ontdekken van geneesmiddelen, maar ook in staat om celcelinteracties te bestuderen. Deze complexiteit is aangepakt in studies over macrofaagmigratie10, het vrijkomen van antimicrobiële peptiden door neutrofielen11, de rol van slijm bij infectie9, en de epitheelcelreactie op overmatige schade12. Echter, een betrouwbare CF-geïnfecteerde in vitro model dat de genetische mutatie in CF functies, dat wordt blootgesteld aan de lucht (verhoogde fysiologische aandoening), en integreert immuuncellen ontbreekt nog steeds.
Om deze kloof te overbruggen, beschrijven we een protocol voor stabiele menselijke 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen. Het model bestaat uit menselijke CF bronchiale epitheelcellen en macrofagen, besmet met P. aeruginosa en in staat om zowel een diffusional als immunologische barrière te vertegenwoordigen. Met het doel om anti-infectieve stoffen te testen bij een redelijk hoge doorvoer, werd deze co-cultuur vastgesteld op het doorlatende filtermembraan van putplaatinserts, met behulp van twee menselijke cellijnen: CFBE41o- en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen. Bovendien, om uiteindelijk de depositie van aerosolized anti-infectives13te bestuderen, werd het model gevestigd op de lucht-vloeibare interface (ALI) in plaats van vloeibare bedekte omstandigheden (LCC).
Zoals we hier rapporteren, maakt dit model het mogelijk om niet alleen bacteriële overleving bij een behandeling met antibiotica te beoordelen, maar ook celcytotoxiciteit, epitheliale barrière-integriteit, macrofaagtransmigratie en ontstekingsreacties, die essentiële parameters zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Dit protocol combineert twee relevante celtypen voor inademingstherapie van de longluchtwegen: macrofagen en CF bronchiale epitheel. Deze cellen zijn gezaaid aan weerszijden van doorlatende steun inserts, waardoor cel blootstelling aan lucht (de zogenaamde lucht-vloeistof interface (ALI) voorwaarden). Deze co-cultuur van gastheercellen wordt vervolgens besmet met P. aeruginosa. Beide gastheercellijnen zijn van menselijke oorsprong: de epitheelcellen vertegenwoordigen het cystische fibrose bronchiale epitheel, met een mutatie op het CF-kanaal (CFBE41o-) en de THP-114 cellen zijn een goed gekarakteriseerde macrofaag-achtige cellijn. Een confluent epitheellaag mag zich eerst vormen aan de bovenzijde van putplaatwisselplaten voordat de macrofaagachtige cellen aan het tegenovergestelde compartiment worden toegevoegd. Zodra de co-cultuur is gevestigd op ALI, wordt het systeem ingeënt met P. aeruginosa aan de apicale kant. Dit geïnfecteerde co-cultuursysteem wordt vervolgens gebruikt om de werkzaamheid van een antibioticum te beoordelen, bijvoorbeeld tobramycine. De volgende eindpunten worden geanalyseerd: epitheelbarrière-integriteit in termen van transepitheliale elektrische resistentie (TEER), visualisatie van celcel- en celbacteriëninteracties door confocale laserscansmicroscopie (CLSM), bacteriële overleving door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU), overleving van gastheercellen (cytotoxiciteit) en cytokine-release.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

fDrug onderzoek voor de behandeling van longinfecties vordert naar voorspellende in vitro modellen van hoge complexiteit. De veelzijdige aanwezigheid van bacteriën in longmodellen kan de epitheliale opstelling opnieuw aanpassen, terwijl immuuncellen een ontstekingsreactie tegen de bacteriën in de microomgeving coördineren. Hoewel in vivo modellen de keuze zijn geweest voor het testen van nieuwe anti-infectiemiddelen in de context van cystische fibrose, bootsen ze nog steeds niet nauwkeurig de in vivo omstandigheden van dergelijke ziekten bij de mens en de behandelingsresultaten na. Complexe in vitro modellen van de geïnfecteerde luchtwegen op basis van menselijke cellen (bronchiale epitheel en macrofagen) en relevante ziekteverwekkers kunnen deze kloof overbruggen en de vertaling van nieuwe anti-infectiemiddelen in de kliniek vergemakkelijken. Voor dergelijke doeleinden is een co-cultuurmodel van de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o- en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen vastgesteld, die een infectie van het menselijk bronchiale slijmvlies nabootsen door P. aeruginosa bij lucht-vloeibare interface (ALI) voorwaarden. Dit model is opgezet in zeven dagen, en de volgende parameters worden tegelijkertijd beoordeeld: epitheelbarrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriële overleving, en ontsteking. Het huidige protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar systeem voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen en reacties die relevant kunnen zijn voor het ontdekken van nieuwe anti-infectiemiddelen en het optimaliseren van hun aerosol levering aan de longen.

Figuur 1A toont de morfologie van de resulterende co-cultuur van menselijke bronchiale epitheelcellen en macrofagen na het kweken van beide voor 24 uur aan de apicale en basolaterale kant van permeabele ondersteunt, respectievelijk. De epitheelbarrière integriteit wordt aangetoond door hogere TEER (834 Ω ×cm2) en CLSM door immunostaining voor de strakke kruising eiwit ZO-1 (Figuur 1B). Dezelfde resultaten waargenomen in termen van barrière integri...

Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Dus als we nieuwe anti-infecties evalueren, moeten we twee dingen aanpakken. Een kant is de bacterie. Als het planktonische of geïnformeerde biofilms zijn, is de andere kant de aanwezigheid van gastheercellen, vooral epitheliale gastheercellen, die strakke biologische barrières vormen.Als deze barrières worden uitgevoerd, hoe de monologische respons zou kunnen zijn, en met dit nieuwe model, kunnen we eigenlijk beide parameters te controleren op hetzelfde moment. Bij de behandeling van bacteriële infecties, moeten we beseffen welk orgaan wordt beïnvloed. Bijvoorbeeld, als het de long is, kunnen we profiteren en het medicijn als aerosol toedienen.Als we echter een model willen hebben om dit te bestuderen, hebben we een model nodig dat ook de positie van aerosolen mogelijk maakt, wat in ons model het geval is. Het andere voordeel is dat het gebaseerd is op menselijke cellen, zodat we problemen kunnen vermijden als gevolg van verschillen tussen dieren en soortenverschillen. Dit systeem kan u meer inzicht geven in het gebied van infectieonderzoek door licht te werpen op moleculaire en cellulaire gebeurtenissen tijdens de interactie van gastheercellen en bacteriën.Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, moet u het celmedium controleren op steriliteit en celmorfologie en voorzichtig zijn bij het hanteren van de doorlaatbare steunen. Cultiveren CFBE41 O minus cellen in een T 75 kolf met minimale essentiële medium met 10%FCS, 1%niet-essentiële aminozuren, en 600 milligram per liter glucose bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Voeg elke twee tot drie dagen vers medium toe aan de cellen.Nadat de cellen 70% samenvloeiing hebben bereikt, was ze met 10 milliliter PBS en maak ze los met drie milliliter trypsine EDTA bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens zeven milliliter verse MEM toe en centrifuge de cellen op 300 keer G gedurende vier minuten. Na het weggooien van de supernatant, op 10 milliliter mem, terwijl het verstoren van de klonten met zachte pipetting.Tel de cellen met een geautomatiseerde celteller of Hemocytometerkamer en verdun ze vervolgens tot een concentratie van 200.000 cellen per 500 microliter voor het zaaien in 12 putplaten met doorlatende steunen. Voeg 500 microliter van de celsuspensie per put toe aan de apicale kant van de doorlaatbare ondersteuning. Voeg vervolgens 1,5 milliliter vers medium toe aan de basale zijzijde.Broed de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 72 uur. Op de derde dag na het zaaien, maak een lucht vloeistof interface door het verwijderen van het medium van de basale laterale kant eerst dan van de apicale kant. Voeg 500 microliter verse MEM toe aan de basale laterale kant en verander het medium elke tweede dag totdat cellen een samenvloeibare monolaag vormen.Om de epitheelbarrière-eigenschappen van de cellen te beoordelen, voegt u 500 microliters van celmedium toe aan de apicale kant en 1,5 milliliter aan de basale zijwaartse zijde, waarna de plaat gedurende een uur naar de couveuse wordt teruggebracht. Meet de transit materiaal elektrische weerstand of TEER met ann STX2 eetstok elektrode en een epitheel volt ohm meter. Om THP1 cellen te cultiveren, groeien ze in de T 75 kolf met behulp van RPMI 1640 medium, aangevuld met 10%FCS bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Splits de cellen elke tweede dag door het zaaien van 2 miljoen cellen per milliliter in een nieuwe T75 kolf. Om de THP1 cellen te onderscheiden, centrifugeren de inhoud van de kolf op 300 keer G gedurende vier minuten, gooi de supernatant. Resuspend de pellet in vers medium en zet in een nieuwe T75 kolf.Voeg 10 nanogram per milliliter PMA toe aan de cellen en breng ze terug naar de couveuse. Om de macrofaag zoals cellen los te maken, was ze eenmaal met PBS op 37 graden Celsius, en broed ze uit met drie milliliter celloslating oplossing met 0,5 millimolar EDTA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Controleer op celloslating onder een omgekeerde microscoop.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, voeg zeven milliliter vers medium en centrifugeren ze op 300 keer G gedurende vier minuten. Na het verwijderen van de supernatant, resuspend de macrofaag cellen in drie milliliter van THP1 medium in een 15 milliliter conische buis, tel de cellen, en uitbroed ze voor een maximum van een uur voor het opzetten van de co-cultuur. Om een epitheel macrofaag co-cultuur vast te stellen, verwijder het medium uit de onderste kamer van de CFBE41 O minus monolagen en voorzichtig omkeren van de steun in een steriele glazen petrischaal, gebruik een cel schraper om de cellen overwoekerd door het membraan poriën te verwijderen.Plaats 200, 000 THP1 macrofagen in 200 microliter rpmi aan de basale zijzijde van de omgekeerde insert in elke put, sluit de petrischaaltjes en broed ze twee uur uit. Plaats vervolgens de wisselplaten terug in de 12 goed microplaten en voeg 500 microliters van MEM medium toe aan de basale laterale kant van de doorlaatbare wisselplaat. Inoculate 15 milliliter lb aangevuld met 300 microgram per milliliter ampicilline met een enkele kolonie P aeruginosa, PAO1GFP, broeden de bacteriën voor 18 uur bij 37 graden Celsius, terwijl schudden op 180 RPM.Breng de bacteriën na de incubatie over op een conische buis van 50 milliliter en centrifuges op 3, 850 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en voeg 10 milliliter steriele PBS toe die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer en pas de concentratie van bacteriën met het celcultuurmedium aan tot een uiteindelijke concentratie van 200.000 kolonievormende eenheden per milliliter, wat overeenkomt met een veelheid van infectie van één bacterie per epitheliale cel.Voeg 100 microliter bacteriële suspensie toe aan de apicale kant van de doorlaatbare steun en broed de plaat uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende een uur om bacteriën aan de cellen te laten hechten, verwijder vervolgens zorgvuldig apicale vloeistof met een pipet om ALI-omstandigheden te herstellen. Voor experimenten met medicamenteuze behandeling, voeg 500 microliters van een drugoplossing verdund in celmedium aan de apicale kant toe. Voeg vervolgens 1,5 milliliter celmedium toe aan de basale zijzijde.Verzamel 500 microliter van het atypische en basale laterale medium en verpool ze om CFU van niet-aangesloten bacteriën te beoordelen. Om de overleving van aangesloten of geïnternaliseerde bacteriën te beoordelen, voeg 500 microliter steriel gedeïmiseerd koud water toe aan elk compartiment van de doorlaatbare ondersteuning en broed de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Als de CFU wordt beoordeeld op bevroren monsters, ontdooit u ze gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.Gebruik dan pipet tips om het membraan oppervlak schraap en zorg ervoor dat niet te veel druk op de putten. Pipette op en neer om alle aangehangen inhoud te verwijderen. Met de bacteriële suspensie van beide fracties, maak een een tot 10 seriële verdunning met PBS tween en plaat van de bacteriën op lb agar platen.Broed de agarplaten 16 tot 72 uur op 30 graden Celsius, tel vervolgens de kolonies en bereken CFU. De morfologie van de resulterende co-cultuur van menselijke bronchiale epitheelcellen en macrofagen aan de apicale en basilicum laterale kant van de permeabele steunen worden hier getoond. Een hogere TEER-meting en immunostaining voor de strakke verbinding eiwitten ZO1, bleek epitheliale barrière integriteit.Om een bacteriële infectie te modelleren, werd P aeruginosa ingeënt op CFBE41 o minus cellen. Macrofagen werden waargenomen aan de apicale kant van de co-cultuur zes uur na infectie. De TEER daalde tot 250 ohm per vierkante centimeter, wat wijst op een gecompromitteerde epitheelbarrière, die ook werd voorgesteld door ZO1 kleuring.Macrofaag trans migratie door de permeabele filter poriën en bacteriën opname door THP-1 cellen aan de apicale kant wordt hier getoond. In de THP-1 monoculturen, macrofaag migratie zo vroeg als een uur na infectie. Ondertussen werd de migratie gezien na drie uren post-besmetting in de co-cultuur.Geïnfecteerde co-culturen behandeld met tobramycine voor zes of 20 uur werden afgebeeld met confocale scannen laser microscopie. Zonder behandeling stierven de epitheelcellen of macrofagen na 20 uur infectie. Ondanks het feit dat gezien na zes uur van de behandeling in de microscopie foto's, een CFU test aangetoond dat de bacteriën niet vermenigvuldigen.Niettemin, de bacteriën herstelden hun proliferatie vermogen na de 20 uur behandeling. TEER van monoculturen en co culturen werden ook gemeten. De co-cultuur van CFBE41 o minus cellen met THP-1 heeft geen veranderingen teweegbrengen in de epitheliale barrière-integriteit ten opzichte van de monocultuur.Bij infectie daalde de TEER-waarde. bij het uitvoeren van deze procedure is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen goed zitten en het filtermembraan niet wordt verstoord. Daarom moeten de celzaaistappen zorgvuldig worden uitgevoerd.Naast dit protocol, verneveling van antibiotica op de inserts zou het mogelijk maken om te zien of bacteriën overleving verandert in vergelijking met onderdompelde omstandigheden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Bepaling van de toelaatbare vetzuren en Cholera toxine Concentraties behulp Human Intestinal epitheelcellen en BALB / c muis macrofagen

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...