Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Ces travaux ont bénéficié d’un financement du programme HORIZON 2020 de l’Union européenne pour la recherche, le développement technologique et la démonstration dans le cadre de l’accord de subvention no 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Conception et développement de nanomédecines avancées pour surmonter les barrières biologiques et traiter les maladies graves. Nous remercions le Dr Ana Costa et le Dr Jenny Juntke pour le grand soutien apporté au développement de la co-culture, Olga Hartwig, pour l’illustration scientifique, Anja Honecker, pour les tests ELISA, Petra König, Jana Westhues et le Dr Chiara De Rossi pour le soutien à la culture cellulaire, à l’analyse et à la microscopie. Nous remercions également Chelsea Thorn d’avoir relu notre manuscrit.

1. Croissance et différenciation des cellules dans les inserts de support perméables
<ol><li>Cultiver CFBE41o- dans une fiole T75 avec 13 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum fœtal de veau (FCS), 1% d’acides aminés non essentiels et 600 mg/L de glucose à 37 °C avec 5 % d’atmosphère CO2. Ajouter un milieu frais aux cellules tous les 2 à 3 jours.<ol>
<li>Détachez les cellules après avoir atteint 70% de confluence dans la fiole avec 3 ml d’acide trypsine- éthy...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+and+host+immunity+to+infection.">Lung dendritic cells and host immunity to infection.</a> European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).</li><li>Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. A., Schulze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+Vaccine+Adjuvant+System+Alum/c-di-AMP+Results+in+Quantitative+and+Qualitative+Enhanced+Immune+Responses+Post+Immunization.">The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).</li><li>Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+selective+autophagy-induction+rescues+&#948;F508-CFTR+and+inhibits+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+cystic+fibrosis.">Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues &#948;F508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis.</a> PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).</li><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Cet article décrit un protocole pour une co-culture 3D des voies respiratoires infectées, constitué par la ligne de cellules épithéliales bronchiques de fibrose kystique humaine CFBE41o- et la ligne de cellules macrophages humaines dérivées de monocytes THP-1. Le protocole permet l’évaluation de l’intégrité des barrières épithéliales, de la transmigration des macrophages, de la survie des bactéries et de l’inflammation, qui sont des paramètres importants lors de l’essai simultané de l’efficacit?...

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène pertinent dans la mucoviscidose (CF) qui contribue à l’affaiblissement des tissus pulmonaires1. La production de polysaccharides, tels que l’alginate et d’autres exopolysaccharides mucoïdes, coordonne la progression de la maladie, qui conduit à l’observance bactérienne tenace, limite la livraison d’antibiotiques aux bactéries et protège les bactéries contre le système immunitaire hôte2. La transition de P. aeruginosa de l’étape planctonique à la formation de biofilm est un problème critique dans ce contexte, facilitant également l’apparition de la tolérance aux antibiotiques.
Dans le contexte des FC, la souris a été principalement utilisée comme modèle. Les souris, cependant, ne développent pas spontanément cette maladie avec l’introduction des mutations de CF3. La plupart des études sur le biofilm bactérien et la susceptibilité aux médicaments ont été réalisées sur des surfaces abiotiques, comme les boîtes de Pétri. Toutefois, cette approche ne représente pas la complexité in vivo. Par exemple, d’importantes barrières biologiques sont absentes, y compris les cellules immunitaires ainsi que l’épithélium muqueuse. Bien que P. aeruginosa soit très toxique pour les cellules épithéliales, certains groupes ont réussi à co-cultiver un biofilm P. aeruginosa plus tôt avec des cellules bronchiques humaines. Ces cellules provenaient de patients atteints de mucoviscidose présentant une mutation CFTR (CFBE41o- cellules)4 et ont permis d’évaluer l’efficacité des antibiotiques5 ou d’évaluer la correction de la protéine CFTR pendant l’infection6. Un tel modèle a été montré pour améliorer la prévisibilité de l’efficacité des médicaments, en plus de permettre la caractérisation des problèmes avec les médicaments qui ont échoué dans les phases ultérieures du développement de médicaments7.
Cependant, dans le poumon, l’épithélium muqueuse est exposé à l’air. En outre, les cellules immunitaires présentes dans les voies respiratoires, comme les macrophages tissulaires, jouent un rôle essentiel contre les agents pathogènes inhalés ou les particules8. Les macrophages migrent à travers les différentes couches cellulaires pour atteindre le lumen bronchique et combattre l’infection. En outre, les médicaments inhalés doivent également faire face à la présence de mucus comme un élément non cellulaire supplémentaire de la barrière pulmonaire air-sang9. En effet, plusieurs modèles in vitro tridimensionnels complexes (3D) ont été développés, dans le but d’accroître la pertinence in vivo. Les systèmes de coculture augmentent non seulement la complexité des systèmes in vitro pour la découverte de médicaments, mais permettent également d’étudier les interactions cellule-cellule. Une telle complexité a été abordée dans des études sur la migration des macrophages10, la libération de peptides antimicrobiens par les neutrophiles11, le rôle du mucus dans l’infection9, et la réaction épithéliale des cellules aux dommages excessifs12. Cependant, un modèle in vitro fiable infecté par les FC qui présente la mutation génétique dans la FIBROSE, qui est exposée à l’air (condition physiologique accrue), et intègre les cellules immunitaires fait encore défaut.
Pour combler cet écart, nous décrivons un protocole pour la co-culture humaine stable 3D des voies respiratoires infectées. Le modèle est constitué de cellules et de macrophages épithéliales bronchiques cf humaine, infectées par P. aeruginosa et capables de représenter à la fois une barrière diffusionnelle et immunologique. Dans le but de tester des anti-infectieux à un débit raisonnablement élevé, cette co-culture a été établie sur la membrane filtrante perméable des inserts de plaque de puits, à l’aide de deux lignées cellulaires humaines : CFBE41o- et macrophages dérivés de monocytes THP-1. En outre, pour étudier éventuellement le dépôt d’anti-infectieux aérosols13, le modèle a été établi à l’interface air-liquide (ALI) plutôt que dans des conditions couvertes par le liquide (LCC).
Comme nous le rapportons ici, ce modèle permet d’évaluer non seulement la survie bactérienne sur un traitement antibiotique, mais aussi la cytotoxicité cellulaire, l’intégrité de barrière épithéliale, la transmigration de macrophage, et les réponses inflammatoires, qui sont des paramètres essentiels pour le développement de drogue.
Ce protocole combine deux types de cellules pertinents pour la thérapie par inhalation des voies respiratoires pulmonaires : les macrophages et l’épithélium bronchique de CF. Ces cellules sont ensemencées sur les côtés opposés des inserts de support perméables, ce qui permet l’exposition cellulaire à l’air (appelé l’interface air-liquide (ALI) conditions). Cette co-culture des cellules hôtes est par la suite infectée par P. aeruginosa. Les deux lignées cellulaires hôtes sont d’origine humaine : les cellules épithéliales représentent l’épithélium bronchique de la fibrose kystique, avec une mutation sur le canal CF (CFBE41o-), et les cellules THP-114 sont une lignée cellulaire bien caractérisée comme un macrophages. Une couche épithéliale confluente est d’abord autorisée à se former sur le côté supérieur des inserts de plaque de puits avant que les cellules macrophage-like soient ajoutées au compartiment opposé. Une fois que la co-culture est établie à ALI, le système est inoculé avec P. aeruginosa du côté apical. Ce système de coculture infecté est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité d’un antibiotique, par exemple la tobramycine. Les points d’extrémité suivants sont analysés : intégrité des barrières épithéliales en termes de résistance électrique transépithéliale (TEER), visualisation des interactions cellule-cellule et cellule-bactériose par microscopie à balayage laser confocale (CLSM), survie bactérienne en comptant les unités de formation de colonies (CFU), survie des cellules hôtes (cytotoxicité) et libération de cytokine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

la recherche sur le traitement des infections pulmonaires progresse vers des modèles in vitro prédictifs de grande complexité. La présence multiforme de bactéries dans les modèles pulmonaires peut ré-adapter l’arrangement épithélial, tandis que les cellules immunitaires coordonnent une réponse inflammatoire contre les bactéries dans le microenvironnement. Bien que les modèles in vivo aient été le choix pour tester de nouveaux anti-infectieux dans le contexte de la mucoviscidose, ils n’imitent toujours pas avec précision les conditions in vivo de ces maladies chez l’homme et les résultats du traitement. Des modèles in vitro complexes des voies respiratoires infectées à base de cellules humaines (épithéliales et macrophages bronchiques) et des agents pathogènes pertinents pourraient combler cet écart et faciliter la traduction de nouveaux anti-infectieux dans la clinique. À cette fin, un modèle de coculture de la lignée épithéliale de la fibrose kystique humaine CFBE41o- et des macrophages dérivés du monocyte THP-1 a été établi, imitant une infection de la muqueuse bronchique humaine par P. aeruginosa à des conditions d’interface air-liquide (ALI). Ce modèle est mis en place en sept jours, et les paramètres suivants sont simultanément évalués : intégrité de barrière épithéliale, transmigration de macrophage, survie bactérienne, et inflammation. Le présent protocole décrit un système robuste et reproductible pour évaluer l’efficacité des médicaments et les réponses de l’hôte qui pourrait être pertinent pour découvrir de nouveaux anti-infectieux et optimiser leur livraison d’aérosols aux poumons.

La figure 1A montre la morphologie de la coculture par rapport aux cellules épithéliales bronchiques humaines et aux macrophages après avoir augmenté à la fois pendant 24 h sur le côté atical et basolateral des supports perméables, respectivement. L’intégrité de la barrière épithéliale est démontrée par teer plus élevé (834 Ω×cm2) et CLSM par immunostaining pour la protéine de jonction serrée ZO-1 (Figure 1B). Les mêmes résult...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Donc, lorsque nous évaluons de nouveaux anti-infectieux, nous devons aborder deux choses. D’un côté, il y a les bactéries. S’il s’agit de biofilms planctoniques ou informés, l’autre côté est la présence de cellules hôtes, en particulier de cellules hôtes épithéliales, qui forment des barrières biologiques serrées.Si ces obstacles sont effet, comment la réponse monologique pourrait être, et avec ce nouveau modèle, nous pouvons effectivement surveiller les deux paramètres en même temps. Lors du traitement des infections bactériennes, nous devons réaliser quel organe est affecté. Par exemple, si c’est le poumon, nous pouvons en profiter, et administrer topiquement le médicament comme aérosol.Toutefois, si nous voulons avoir un modèle pour étudier cela, nous avons besoin d’un modèle qui permet également la position des aérosols, ce qui est le cas dans notre modèle. L’autre avantage est qu’il est basé sur des cellules humaines, afin que nous puissions éviter les problèmes dus aux différences avec les animaux et les espèces. Ce système pourrait vous donner plus de perspicacité dans le domaine de la recherche sur les infections en jetant la lumière sur les événements moléculaires et cellulaires au cours de l’interaction des cellules hôtes et des bactéries.Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, n’oubliez pas de vérifier le milieu cellulaire pour la stérilité et la morphologie cellulaire et d’être prudent lors de la manipulation des supports perméables. Cultivez les cellules CFBE41 O moins dans un flacon T 75 avec un milieu essentiel minimum contenant 10 % de SFC, 1 % d’acides aminés non essentiels et 600 milligrammes par litre de glucose à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Ajouter le milieu frais aux cellules tous les deux à trois jours.Après que les cellules ont atteint 70% de confluence, lavez-les avec 10 millilitres de PBS et détachez-les avec trois millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, ajouter sept millilitres de MEM frais et centrifuger les cellules à 300 fois G pendant quatre minutes. Après avoir jeté le supernatant, à 10 millilitres de MEM, tout en perturbant les touffes avec pipetting doux.Comptez les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou une chambre d’hémocytomètre, puis diluez-les à une concentration de 200 000 cellules par 500 microlitres pour l’ensemencement dans 12 plaques de puits avec des supports perméables. Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire par puits au côté apical du support perméable. Ajouter ensuite 1,5 millilitres de milieu frais au côté latéral basal.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Le troisième jour après l’ensemencement, créer une interface liquide d’air en enlevant le milieu du côté latéral basal d’abord puis du côté apical. Ajouter 500 microlitres de MEM frais au côté latéral basal et changer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules forment un monocouche confluent.Pour évaluer les propriétés de barrière épithéliale des cellules, ajoutez 500 microlitres de milieu cellulaire au côté apical, et 1,5 millilitres au côté latéral basal, puis retournez la plaque à l’incubateur pendant une heure. Mesurez la résistance électrique des matériaux de transit ou TEER à l’aide d’une électrode à baguette ann STX2 et d’un compteur d’ohm volt épithéliale. Pour cultiver les cellules THP1, cultivez-les dans le flacon T 75 à l’aide du milieu RPMI 1640, complété par 10% de FCS à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Divisez les cellules tous les deux jours en ensemencement de 2 millions de cellules par millilitre dans un nouveau flacon T75. Pour différencier les cellules THP1, centrifuger le contenu du flacon à 300 fois G pendant quatre minutes, jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans un milieu frais et mettez dans un nouveau flacon T75.Ajouter 10 nanogrammes par millilitre de PMA aux cellules et les retourner à l’incubateur. Pour détacher le macrophage comme des cellules, lavez-les une fois avec PBS à 37 degrés Celsius, et incubez-les avec trois millilitres de solution de détachement cellulaire contenant 0,5 millimolar EDTA pendant 10 minutes à température ambiante. Vérifiez s’il y a un décollement cellulaire au microscope inversé.Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter sept millilitres de milieu frais et les centrifuger à 300 fois G pendant quatre minutes. Après avoir enlevé le supernatant, resuspendez les cellules macrophages en trois millilitres de milieu THP1 dans un tube conique de 15 millilitres, comptez les cellules et incubez-les pendant un maximum d’une heure avant de mettre en place la co-culture. Pour établir une co-culture épithéliale de macrophage, retirez le milieu de la chambre inférieure du CFBE41 O moins les monocouches et inversez soigneusement le support à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre stérile, utilisez un grattoir cellulaire pour enlever les cellules envahies par les pores membranaires.Placez 200 000 macrophages THP1 dans 200 microlitres de RPMI sur le côté latéral basal de l’insert inversé dans chaque puits, fermez les boîtes de Petri et incubez-les pendant deux heures. Ensuite, placez les inserts de nouveau dans les 12 plaques micro puits et ajouter 500 microlitres de milieu MEM sur le côté latéral basal de l’insert perméable. Inoculer 15 millilitres de lb complétés par 300 microgrammes par ampicilline millilitre avec une seule colonie de P aeruginosa, PAO1GFP, incuber la bactérie pendant 18 heures à 37 degrés Celsius, tout en secouant à 180 RPM.Après l’incubation, transférer les bactéries dans un tube conique de 50 millilitres et les centrifugeuses à 3 850 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Mesurer la densité optique à 600 nanomètres et ajuster la concentration de bactéries avec le milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 200 000 unités de formation de colonies par millilitre, ce qui correspond à une multiplicité d’infection d’une bactérie par cellule épithéliale.Ajouter 100 microlitres de suspension bactérienne sur le côté apical du support perméable et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure pour permettre aux bactéries de se fixer aux cellules, puis retirer soigneusement le liquide apical avec une pipette pour restaurer les conditions ALI. Pour des expériences avec le traitement de drogue, ajoutez 500 microlitres d’une solution de drogue diluée dans le milieu cellulaire au côté apical. Ajouter ensuite 1,5 millilitres de milieu cellulaire au côté latéral basal.Recueillir 500 microlitres du milieu latéral atypique et basal et les mettre en commun pour évaluer le CFU des bactéries non attachées. Pour évaluer la survie des bactéries attachées ou intériorisées, ajoutez 500 microlitres d’eau froide déionisée stérile à chaque compartiment du support perméable et incubez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Si vous évaluez l’UNIVERSITÉ à partir d’échantillons congelés, décongelez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, utilisez des pointes de pipette pour gratter la surface de la membrane en prenant soin de ne pas mettre trop de pression sur les puits. Pipette de haut en bas pour supprimer tout contenu adhéré. Avec la suspension bactérienne des deux fractions, faire une dilution en série d’un à 10 avec l’interpolation PBS et plaquer les bactéries sur les plaques d’agar lb.Incuber les plaques d’agar à 30 degrés Celsius pendant 16 à 72 heures, puis compter les colonies et calculer cfu. La morphologie de la co-culture résultante des cellules épithéliales bronchiques humaines et des macrophages sur le côté latéral apical et basilic des supports perméables sont montrées ici. Une mesure et une immunostaining teer plus élevées pour les protéines de jonction serrée ZO1, se sont avérées l’intégrité épithéliale de barrière.Pour modéliser une infection bactérienne, P aeruginosa a été inoculé sur les cellules CFBE41 o moins. Des macrophages ont été observés sur le côté apical de la co-culture six heures après infection. Le TEER est tombé à 250 ohm par centimètre carré, indiquant une barrière épithéliale compromise, qui a également été suggérée par la coloration ZO1.Macrophage trans migration à travers les pores du filtre perméable et l’absorption des bactéries par les cellules THP-1 sur le côté apical est montré ici. Dans les monocultures THP-1, la migration des macrophages dès une heure après l’infection. Pendant ce temps, la migration a été observée après trois heures après l’infection dans la co-culture.Les co-cultures infectées traitées avec de la tobramycine pendant six ou vingt heures ont été photographiées par microscopie laser à balayage confoccal. Sans traitement, les cellules épithéliales ou les macrophages sont morts après 20 heures d’infection. En dépit d’être vu après six heures de traitement dans les images de microscopie, un essai de CFU a démontré que les bactéries n’ont pas proliféré.Néanmoins, les bactéries ont récupéré leur capacité de prolifération après le traitement de 20 heures. TEER des monocultures et des co-cultures ont également été mesurés. La co-culture des cellules CFBE41 o moins avec THP-1 n’a induit aucun changement dans l’intégrité épithéliale de barrière comparée à la monoculture.Lors de l’infection, la valeur TEER a chuté. lors de l’exécution de cette procédure, il est crucial de s’assurer que les cellules sont bien assises et que la membrane filtrante n’est pas perturbée. Par conséquent, les étapes d’ensemencement cellulaire doivent être effectuées avec soin.En plus de ce protocole, la nébulisation des antibiotiques sur les inserts permettrait de voir si la survie des bactéries change par rapport aux conditions submersées.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Recherche

Immunologie et infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Détermination des acides gras tolérables et concentrations de toxine du choléra en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines et BALB / c macrophages de souris

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

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Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

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Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...