Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Diese Arbeit wurde aus dem HORIZON 2020-Programm der Europäischen Union für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design und Entwicklung fortgeschrittener Nanoarzneimittel zur Überwindung biologischer Barrieren und zur Behandlung schwerer Krankheiten finanziert. Wir danken Dr. Ana Costa und Dr. Jenny Juntke für die große Unterstützung bei der Entwicklung der Co-Kultur, Olga Hartwig, für die wissenschaftliche Illustration, Anja Honecker, für ELISA-Assays, Petra König, Jana Westhues und Dr. Chiara De Rossi für die Unterstützung in den Fächern Zellkultur, Analytik und Mikroskopie. Wir danken auch Chelsea Thorn für das Korrekturlesen unseres Manuskripts.

1. Wachstum und Differenzierung von Zellen in durchlässigen Stützeinsätzen
<ol><li>CFBE41o kultivieren- in einem T75-Kolben mit 13 ml minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS), 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 600 mg/L Glukose bei 37 °C mit 5 %CO2-Atmosphäre. Fügen Sie den Zellen alle 2–3 Tage frisches Medium hinzu.<ol>
<li>Lösen Sie die Zellen nach Erreichen von 70% Zusammenfluss im Kolben mit 3 ml Trypsin- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37°C f...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. 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Dieses Papier beschreibt ein Protokoll für eine 3D-Kokultur der infizierten Atemwege, bestehend aus der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und der menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagenzelllinie THP-1. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, des Überlebens von Bakterien und Entzündungen, die wichtige Parameter bei der gleichzeitigen Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und der Wirtsreaktionen sind. Die Neuheit im Modell lie...

Pseudomonas aeruginosa ist ein relevanter Erreger bei Mukoviszidose (CF), der zur Beeinträchtigung des Lungengewebes beiträgt1. Die Produktion von Polysacchariden, wie Alginat und anderen Mukoid-Exopolysacchariden, koordiniert den Krankheitsverlauf, der zu einer hartnäckigen bakteriellen Haftung führt, die Abgabe von Antibiotika an Bakterien begrenzt und die Bakterien vor dem Wirtsimmunsystem schützt2. Der Übergang von P. aeruginosa vom planktonischen Stadium zur Biofilmbildung ist in diesem Zusammenhang ein kritisches Thema, das auch das Auftreten von Antibiotikatoleranz erleichtert.
Im Kontext von CF wurde die Maus in erster Linie als Modell verwendet. Mäuse entwickeln diese Krankheit jedoch nicht spontan mit der Einführung von CF-Mutationen3. Die meisten bakteriellen Biofilm-Entwicklung und Arzneimittelanfälligkeit Studien wurden auf abiotischen Oberflächen durchgeführt, wie Petri-Gerichte. Dieser Ansatz stellt jedoch nicht die In-vivo-Komplexität dar. So fehlen wichtige biologische Barrieren, darunter Immunzellen sowie das Schleimhautepithel. Obwohl P. aeruginosa ziemlich toxisch für Epithelzellen ist, haben es einige Gruppen geschafft, einen früheren P. aeruginosa Biofilm mit menschlichen Bronchialzellen zu kultivieren. Diese Zellen stammten von Mukoviszidose-Patienten mitCFTR-Mutation (CFBE41o - Zellen)4 und erlaubten es, die Wirksamkeit von Antibiotika5 zu bewerten oder die Korrektur des CFTR-Proteins während der Infektion6zu bewerten. Ein solches Modell wurde gezeigt, um die Vorhersehbarkeit der Wirksamkeit von Arzneimitteln zu verbessern, zusätzlich zur Aktivierung der Charakterisierung von Problemen mit Medikamenten, die in späteren Phasen der Arzneimittelentwicklung versagten7.
In der Lunge wird das Schleimhautepithel jedoch der Luft ausgesetzt. Darüber hinaus spielen Immunzellen in den Atemwegen, wie Gewebemakrophagen, eine wesentliche Rolle gegen eingeatmete Krankheitserreger oder Partikel8. Makrophagen wandern durch die verschiedenen Zellschichten, um das Bronchiallumen zu erreichen und die Infektion zu bekämpfen. Darüber hinaus müssen inhalierte Medikamente auch mit dem Vorhandensein von Schleim als zusätzliches nichtzelluläres Element der Lungenluft-Blut-Barriere9zurechtkommen. Tatsächlich wurden mehrere komplexe dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt, die darauf abzielen, die In-vivo-Relevanz zu erhöhen. Co-Kultursysteme erhöhen nicht nur die Komplexität von In-vitro-Systemen für die Arzneimittelentdeckung, sondern ermöglichen auch die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Diese Komplexität wurde in Studien über Makrophagenmigration10, die Freisetzung von antimikrobiellen Peptiden durch Neutrophile11, die Rolle des Schleims beiInfektionen 9, und die Epithelzellreaktion auf übermäßige Schäden12behandelt. Ein zuverlässiges CF-infiziertes In-vitro-Modell, das die genetische Mutation in CF aufweist, der Luft ausgesetzt ist (erhöhter physiologischer Zustand), und Immunzellen integriert, fehlt noch.
Um diese Lücke zu überbrücken, beschreiben wir ein Protokoll für eine stabile menschliche 3D-Kokultur der infizierten Atemwege. Das Modell besteht aus menschlichen CF-Bronchialepithelzellen und Makrophagen, die mit P. aeruginosa infiziert sind und sowohl eine diffusionale als auch eine immunologische Barriere darstellen können. Mit dem Ziel, Anti-Infektiva bei einem relativ hohen Durchsatz zu testen, wurde diese Co-Kultur auf der durchlässigen Filtermembran von Wellplatteneinsätzen unter Verwendung von zwei menschlichen Zelllinien etabliert: CFBE41o- und THP-1 Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Darüber hinaus wurde das Modell zur Untersuchung der Ablagerung von aerosolisierten Antiinfektiva13an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) und nicht an liquiden abgedeckten Bedingungen (LCC) etabliert.
Wie wir hier berichten, ermöglicht dieses Modell nicht nur die Beurteilung des bakteriellen Überlebens bei einer Antibiotikabehandlung, sondern auch die Zellzytotoxizität, die Integrität der Epithelbarriere, die Makrophagentransmigration und die Entzündungsreaktionen, die wesentliche Parameter für die Arzneimittelentwicklung sind.
Dieses Protokoll kombiniert zwei relevante Zelltypen für die Inhalationstherapie der Lungenwege: Makrophagen und CF-Bronchialepithel. Diese Zellen werden auf gegenüberliegenden Seiten von durchlässigen Stützeinsätzen gesät, wodurch die Zellexposition gegenüber Luft (sogenannte Air-Liquid Interface (ALI)-Bedingungen) möglich ist. Diese Kokultur der Wirtszellen wird anschließend mit P. aeruginosainfiziert. Beide Wirtszelllinien sind menschlicher Herkunft: Die Epithelzellen stellen das mukovisenfibrosebronchiale Epithel dar, mit einer Mutation auf dem CF-Kanal (CFBE41o- ),und die THP-114-Zellen sind eine gut charakterisierte Makrophage-ähnliche Zelllinie. Eine konfluente Epithelschicht darf sich zunächst auf der Oberseite von Brunnenplatteneinsätzen bilden, bevor die makrophageähnlichen Zellen dem gegenüberliegenden Fach hinzugefügt werden. Sobald die Kokultur bei ALI etabliert ist, wird das System mit P. aeruginosa an der apikalen Seite geimpft. Dieses infizierte Co-Kultursystem wird dann verwendet, um die Wirksamkeit eines Antibiotikums, z. B. Tobramycin, zu bewerten. Folgende Endpunkte werden analysiert: epitheliale Barriereintegrität in Bezug auf transepitheliale elektrische Resistenz (TEER), Visualisierung von Zell-Zell- und Zell-Bakterien-Wechselwirkungen durch konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM), bakterielles Überleben durch Zählung koloniebildender Einheiten (CFU), Überleben der Wirtszellen (Zytotoxizität) und Zytokinfreisetzung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

fDie Arzneimittelforschung zur Behandlung von Lungeninfektionen schreitet zu prädiktiven In-vitro-Modellen von hoher Komplexität bei. Die vielfältige Präsenz von Bakterien in Lungenmodellen kann die epitheliale Anordnung wieder anpassen, während Immunzellen eine Entzündungsreaktion gegen die Bakterien in der Mikroumgebung koordinieren. Während In-vivo-Modelle die Wahl waren, um neue Anti-Infektiva im Zusammenhang mit Mukoviszidose zu testen, imitieren sie immer noch nicht genau die In-vivo-Bedingungen solcher Krankheiten beim Menschen und die Behandlungsergebnisse. Komplexe In-vitro-Modelle der infizierten Atemwege auf der Grundlage menschlicher Zellen (Bronchialepithel und Makrophagen) und relevanter Krankheitserreger könnten diese Lücke überbrücken und die Übersetzung neuer Antiinfektiva in die Klinik erleichtern. Zu diesem Zweck wurde ein Kokulturmodell der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und THP-1-Monozyten-abgeleiteten Makrophagen etabliert, das eine Infektion der menschlichen Bronchialschleimhaut durch P. aeruginosa unter Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) nachahmt. Dieses Modell wird in sieben Tagen eingerichtet, und die folgenden Parameter werden gleichzeitig bewertet: Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, bakterielles Überleben und Entzündungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares System zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und wirtsreaktionen, die für die Entdeckung neuer Antiinfektiva und die Optimierung ihrer Aerosolzufuhr in die Lunge relevant sein könnten.

Abbildung 1A zeigt die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen, nachdem sie sowohl für 24 h auf der apikalen bzw. basolateralen Seite durchlässiger Stützen gewachsen sind. Die Epithelbarriereintegrität wird durch höhere TEER (834 x2) und CLSM durch Immunfärbung für das enge Knotenprotein ZO-1 (Abbildung 1B) gezeigt. Die gleichen Ergebnisse, die in Bezug auf die- Barriereintegrität ...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Wenn wir also neuartige Antiinfektiva bewerten, müssen wir uns mit zwei Dingen befassen. Eine Seite sind die Bakterien. Wenn es sich um planktonische oder informierte Biofilme handelt, ist die andere Seite das Vorhandensein von Wirtszellen, insbesondere epithelialen Wirtszellen, die enge biologische Barrieren bilden.Wenn diese Barrieren bewirkt werden, wie die monologische Reaktion sein könnte, und mit diesem neuen Modell können wir tatsächlich beide Parameter gleichzeitig überwachen. Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen müssen wir erkennen, welches Organ betroffen ist. Zum Beispiel, wenn es die Lunge ist, können wir nutzen, und topisch das Medikament als Aerosol verabreichen.Wenn wir jedoch ein Modell haben wollen, um dies zu untersuchen, brauchen wir ein Modell, das auch die Position von Aerosolen ermöglicht, wie es in unserem Modell der Fall ist. Der andere Vorteil ist, dass es auf menschlichen Zellen basiert, so dass wir Probleme aufgrund von Unterschieden zu Tieren und Arten unterschieden vermeiden können. Dieses System könnte Ihnen mehr Einblick in das Gebiet der Infektionsforschung geben, indem es Licht auf molekulare und zelluläre Ereignisse während der Interaktion von Wirtszellen und Bakterien wirft.Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, das Zellmedium auf Sterilität und Zellmorphologie zu überprüfen und vorsichtig zu sein, wenn Sie mit den durchlässigen Stützen umgehen. Kultivieren Sie CFBE41 O Minuszellen in einem T 75-Kolben mit einem minimalen essentiellen Medium mit 10%FCS, 1%nicht-essentiellen Aminosäuren und 600 Milligramm pro Liter Glukose bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Fügen Sie den Zellen alle zwei bis drei Tage frisches Medium hinzu.Nachdem die Zellen 70% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie sie mit 10 MilliliterPBS und lösen Sie sie 15 Minuten lang mit drei Millilitern Trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius. Dann fügen Sie sieben Milliliter frisches MEM hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für vier Minuten. Nach dem Wegwerfen des Überstandes bei 10 MillilitermeM, während die Klumpen mit sanften Pipetten gestört werden.Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometerkammer, dann verdünnen Sie sie auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro 500 Mikroliter für die Aussaat in 12 Brunnenplatten mit durchlässigen Stützen. Fügen Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension pro Brunnen auf die apikale Seite der durchlässigen Unterstützung. Dann 1,5 Milliliter frisches Medium auf die basale Seitenseite geben.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Am dritten Tag nach der Aussaat, erstellen Sie eine Luftflüssigkeitsschnittstelle, indem Sie das Medium von der basalen Seitenseite zuerst dann von der apikalen Seite entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter frisches MEM auf die basale Seitenseite und ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis Zellen eine konfluente Monoschicht bilden.Um die epitheliale Barriereeigenschaften der Zellen zu bewerten, fügen Sie 500 Mikroliter Zellmedium zur apikalen Seite und 1,5 Milliliter zur Basalseite hinzu und geben die Platte dann für eine Stunde an den Inkubator zurück. Messen Sie den elektrischen Transitmaterial oder TEER mit ann STX2 Essstäbchenelektrode und einem Epithelvolt Ohm Meter. Um THP1-Zellen zu kultivieren, wachsen sie im T 75 Kolben mit RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10%FCS bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Teilen Sie die Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie 2 Millionen Zellen pro Milliliter in einem neuen T75-Kolben säen. Um die THP1-Zellen zu unterscheiden, zentrifugieren Sie den Inhalt des Kolbens bei 300 mal G für vier Minuten, entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in frischem Medium aussetzen und in einen neuen T75-Kolben geben.Fügen Sie den Zellen 10 Nanogramm pro Milliliter PMA hinzu und geben Sie sie an den Inkubator zurück. Um die Makrophagen wie Zellen zu lösen, waschen Sie sie einmal mit PBS bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie mit drei Millilitern Zellablösung, die 0,5 Millimolar EDTA für 10 Minuten bei Raumtemperatur enthält. Prüfen Sie die Zellablösung unter einem invertierten Mikroskop.Wenn sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie sieben Milliliter frisches Medium hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für vier Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes die Makrophagenzellen in drei MilliliterTH1-Medium in einem 15-Milliliter-Konikonröhre wieder aufheben, die Zellen zählen und maximal eine Stunde lang inkubieren, bevor sie die Kokultur einrichten. Um eine epitheliale Makrophagen-Kokultur zu etablieren, entfernen Sie das Medium aus der unteren Kammer der CFBE41 O Minus-Monolayer und invertieren Sie vorsichtig die Stütze in einer sterilen Glas-Petrischale, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen, die durch die Membranporen überwuchert sind.Legen Sie 200 000 THP1-Makrophagen in 200 Mikroliter RPMI auf die basale Seitenseite des invertierten Einsatzes in jedem Brunnen, schließen Sie die Petri-Gerichte und inkubieren Sie sie für zwei Stunden. Legen Sie die Einsätze dann wieder in die 12 gut Mikroplatten und fügen Sie 500 Mikroliter MEM-Medium auf die basale Seitenseite des durchlässigen Einsatzes ein. Impfen 15 Milliliter lb ergänzt mit 300 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin mit einer einzigen Kolonie von P aeruginosa, PAO1GFP, inkubieren die Bakterien für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius, während schütteln bei 180 U/min.Nach der Inkubation die Bakterien in ein 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 3, 850 mal G für fünf Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter sterilen PBS hinzu, der auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Messen Sie die optische Dichte mit 600 Nanometern und passen Sie die Konzentration von Bakterien mit dem Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 200.000 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter an, was einer Vielzahl von Infektionen eines Bakteriums pro Epithelzelle entspricht.Fügen Sie 100 Mikroliter bakterielle Suspension auf der apikalen Seite der durchlässigen Stütze hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde, damit Bakterien an den Zellen befestigt werden können, und entfernen Sie dann vorsichtig apikale Flüssigkeit mit einer Pipette, um ALI-Bedingungen wiederherzustellen. Für Experimente mit medikamentöser Behandlung 500 Mikroliter einer im Zellmedium verdünnten Wirkstofflösung zur apikalen Seite hinzufügen. Dann 1,5 Milliliter Zellmedium auf die basale Seitenseite geben.Sammeln Sie 500 Mikroliter des atypischen und basalen Seitenmediums und bündeln Sie sie, um die KBE nicht angeschlossener Bakterien zu bewerten. Um das Überleben von angeschlossenen oder verinnerlichten Bakterien zu beurteilen, fügen Sie 500 Mikroliter sterilen entionisierten kalten Wassers in jedes Fach des durchlässigen Trägers ein und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn Sie Die KBE aus gefrorenen Proben bewerten, tauen Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.Dann verwenden Sie Pipettenspitzen, um die Membranoberfläche zu kratzen, wobei darauf geachtet wird, dass die Brunnen nicht zu stark unter Druck gesetzt werden. Pipette nach oben und unten, um alle haftenden Inhalte zu entfernen. Mit der bakteriellen Suspension aus beiden Fraktionen, machen Sie eine ein bis zehn serielle Verdünnung mit PBS Tween und platte die Bakterien auf lb Agar Platten.Inkubieren Sie die Agarplatten bei 30 Grad Celsius für 16 bis 72 Stunden, zählen Sie dann die Kolonien und berechnen Sie die KBE. Die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen auf der apikalen und basilikanen Seitenseite der durchlässigen Stützen wird hier gezeigt. Eine höhere TEER-Messung und Immunfärbung für die engen Knotenproteine ZO1 erwies sich als epitheliale Barriereintegrität.Um eine bakterielle Infektion zu modellieren, wurde P aeruginosa auf CFBE41 o minus Zellen geimpft. Makrophagen wurden sechs Stunden nach der Infektion auf der apikalen Seite der Co-Kultur beobachtet. Der TEER fiel auf 250 Ohm pro Zentimeter quadratisch, was auf eine kompromittierte Epithelbarriere hindeutet, die auch durch ZO1-Färbung vorgeschlagen wurde.Die Makrophagen-Transmigration durch die durchlässigen Filterporen und die Bakterienaufnahme durch THP-1-Zellen auf der apikalen Seite wird hier gezeigt. In den THP-1-Monokulturen, Makrophagenmigration bereits eine Stunde nach der Infektion. In der Zwischenzeit wurde die Migration nach drei Stunden nach der Infektion in der Co-Kultur gesehen.Infizierte Kokulturen, die sechs oder 20 Stunden lang mit Tobramycin behandelt wurden, wurden mit konfokaler Scanlasermikroskopie abgebildet. Ohne Behandlung starben entweder die Epithelzellen oder Makrophagen nach 20 Stunden Infektion. Obwohl sie nach sechs Stunden Behandlung in den Mikroskopiebildern gesehen wurden, zeigte ein CFU-Test, dass sich die Bakterien nicht vermehrten.Dennoch erholten sich die Bakterien nach der 20-stündigen Behandlung wieder. TEER von Monokulturen und Kokulturen wurden ebenfalls gemessen. Die Kokultur von CFBE41 o minus Zellen mit THP-1 induzierte keine Veränderungen in der Epithelbarriereintegrität im Vergleich zur Monokultur.Bei einer Infektion sank der TEER-Wert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Zellen richtig sitzen und die Filtermembran nicht gestört wird. Daher müssen die Zellsaatschritte sorgfältig durchgeführt werden.Zusätzlich zu diesem Protokoll würde die Vernebelung von Antibiotika auf den Einsätzen es ermöglichen, zu sehen, ob sich das Überleben von Bakterien im Vergleich zu den untergetauchten Bedingungen ändert.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Bestimmung der tolerierbaren Fettsäuren und Cholera Toxin-Konzentrationen mit menschlichen Darm-Epithelzellen und BALB / c Maus-Makrophagen

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...