Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal programma HORI-2020 dell'Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Progettazione e sviluppo di nanomedicine avanzate per superare le barriere biologiche e per il trattamento di gravi malattie. Ringraziamo la Dott.ssa Ana Costa e la Dott.ssa Jenny Juntke per il grande sostegno allo sviluppo della co-cultura, Olga Hartwig, per l'illustrazione scientifica, Anja Honecker, per i saggi ELISA, Petra Kànig, Jana Westhues e la dott.ssa Chiara De Rossi per il supporto alla cultura cellulare, all'analisi e alla microscopia. Ringraziamo anche Chelsea Thorn per aver letto il nostro manoscritto.

1. Crescita e differenziazione delle cellule negli inserti di supporto permeabili
<ol><li>Coltivare CFBE41o- in una fiaschetta T75 con 13 mL di mezzo minimo essenziale (MEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS), 1% di amminoacidi non essenziali e glucosio 600 mg/L a 37 gradi centigradi con 5 % di atmosfera di CO2. Aggiungere mezzo fresco alle cellule ogni 2-3 giorni.<ol>
<li>Staccare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza nel pallone con 3 mL di trypsin- acido etilenedia...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Questo documento descrive un protocollo per una co-coltura 3D delle vie aeree infette, costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dalla linea cellulare macrofamizza derivata dal monocito umano THP-1. Il protocollo consente la valutazione dell'integrità della barriera epiteliale, della trasmigrazione dei macrofagio, della sopravvivenza dei batteri e dell'infiammazione, che sono parametri importanti quando si testano l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite contemporanea...

Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno rilevante nella fibrosi cistica (CF) che contribuisce al danno del tessutopolmonare 1. La produzione di polisaccharides, come l'alginato e altri esopolidi mucoidi, coordina il progresso della malattia, che porta ad una tenace aderenza batterica, limita la somministrazione di antibiotici ai batteri e protegge i batteri contro il sistema immunitario dell'ospite2. La transizione di P. aeruginosa dallo stadio planctonic alla formazione di biofilm è una questione critica in questo contesto, facilitando anche l'insorgenza della tolleranza antibiotica.
Nel contesto di CF, il mouse è stato utilizzato principalmente come modello. I topi, tuttavia, non sviluppano spontaneamente questa malattia con l'introduzione di mutazioni CF3. La maggior parte dello sviluppo di biofilm batterici e studi di suscettibilità ai farmaci sono stati eseguiti su superfici abiotiche, come i piatti Petri. Tuttavia, questo approccio non rappresenta la complessità in vivo. Ad esempio, sono assenti importanti barriere biologiche, comprese le cellule immunitarie e l'epitelio mucoso. Anche se P. aeruginosa è abbastanza tossico per le cellule epiteliali, alcuni gruppi sono riusciti a co-coltivare un precedente biofilm P. aeruginosa con cellule bronchiali umane. Queste cellule hanno avuto origine da pazienti affetti da fibrosi cistica con mutazione CFTR (CFBE41o- cellule)4 e hanno permesso di valutare l'efficacia antibiotica5 o valutare la correzione della proteina CFTR durante l'infezione6. Tale modello è stato indicato per migliorare la prevedibilità dell'efficacia dei farmaci, oltre a consentire la caratterizzazione dei problemi con i farmaci che non sono riusciti nelle fasi successive dello sviluppo di farmaci7.
Tuttavia, nel polmone, l'epitelio mucoso è esposto all'aria. Inoltre, le cellule immunitarie presenti nelle vie aeree, come i macrofagi tissed, svolgono un ruolo essenziale contro gli agenti patogeni inalati o le particelle8. I macrofagi migrano attraverso i diversi strati cellulari per raggiungere il lume bronchiale e combattere l'infezione. Inoltre, i farmaci inalati devono anche far fronte alla presenza di muco come elemento aggiuntivo non cellulare della barriera polmonare aria-sangue9. Infatti, sono stati sviluppati diversi modelli complessi tridimensionali (3D) in vitro, con l'obiettivo di aumentare la rilevanza in vivo. I sistemi di co-coltura non solo aumentano la complessità dei sistemi in vitro per la scoperta di farmaci, ma consentono anche di studiare le interazioni tra cellule cellulari. Tale complessità è stata affrontata negli studi sulla migrazione dei macrofago10, il rilascio di peptidi antimicrobici da parte dei neutrofili11, il ruolo del muconell'infezione 9e la reazione cellulare epiteliale a dannieccessivi 12. Tuttavia, un modello in vitro affidabile infettato da CF che presenta la mutazione genetica in CF, che è esposto all'aria (maggiore condizione fisiologica), e integra le cellule immunitarie è ancora carente.
Per colmare questa lacuna, descriviamo un protocollo per la co-coltura 3D umana stabile delle vie aeree infette. Il modello è costituito da cellule epiteliali e macrofagi bronchiali CF umani, infettati da P. aeruginosa e in grado di rappresentare sia una barriera diffusionale che immunologica. Con l'obiettivo di testare gli anti-infettivi a un rendimento ragionevolmente elevato, questa co-coltura è stata stabilita sulla membrana filtro permeabile di inserti a piastre ben, utilizzando due linee cellulari umane: CFBE41o- e macrofagi derivati da monociti THP-1. Inoltre, per studiare alla fine la deposizione di anti-infettivi aerosolizzati13, il modello è stato stabilito all'interfaccia aria-liquido (ALI) piuttosto che alle condizioni di trattamento con liquido (LCC).
Come riferiamo qui, questo modello permette di valutare non solo la sopravvivenza batterica su un trattamento antibiotico, ma anche la citotossicità cellulare, l'integrità della barriera epiteliale, la trasmigrazione dei macrophage e le risposte infiammatorie, che sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.
Questo protocollo combina due tipi di cellule rilevanti per la terapia dell'inalazione delle vie aeree polmonari: i macrofagi e l'epitelio bronchiale CF. Queste cellule sono semi su lati opposti di inserti di supporto permeabili, permettendo l'esposizione delle cellule all'aria (chiamata condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questa co-coltura delle cellule ospitante viene successivamente infettata da P. aeruginosa. Entrambe le linee cellulari ospitali sono di origine umana: le cellule epiteliali rappresentano l'epitelio bronchiale della fibrosi cistica, con una mutazione sul canale CF (CFBE41o-), e le cellule THP-114 sono una linea cellulare macrofamiga ben caratterizzata. Uno strato epiteliale confluente è prima permesso di formarsi sul lato superiore degli inserti di piastra del pozzo prima che le cellule macrofagi vengono aggiunte al vano opposto. Una volta stabilita la co-cultura in ALI, il sistema viene inoculato con P. aeruginosa sul lato apical. Questo sistema di co-coltura infetto viene quindi utilizzato per valutare l'efficacia di un antibiotico, ad esempio tobramicina. Vengono analizzati i seguenti punti finali: integrità della barriera epiteliale in termini di resistenza elettrica transepithelial (TEER), visualizzazione delle interazioni cellula-cellula-cellula-batterio mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), sopravvivenza batterica mediante conteggio di unità formanti di colonia (CFU), sopravvivenza delle cellule ospite (citotossicità) e rilascio di citochine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

f La ricerca antidroga per il trattamento delle infezioni polmonari sta progredendo verso modelli in vitro predittivi di elevata complessità. La presenza multiforme di batteri nei modelli polmonari può riapproizionare la disposizione epiteliale, mentre le cellule immunitarie coordinano una risposta infiammatoria contro i batteri nel microambiente. Mentre i modelli in vivo sono stati la scelta per testare nuovi anti-infettivi nel contesto della fibrosi cistica, non imitano ancora con precisione le condizioni in vivo di tali malattie negli esseri umani e gli esiti del trattamento. Modelli complessi in vitro delle vie aeree infette basate su cellule umane (epiteliali bronchiali e macrofagi) e agenti patogeni rilevanti potrebbero colmare questa lacuna e facilitare la traduzione di nuovi anti-infettivi nella clinica. Per tali scopi, è stato stabilito un modello di co-coltura della linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dei macrofagi derivati dai monociti THP-1, che imitano un'infezione della mucosa bronchiale umana da P. aeruginosa in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questo modello è impostato in sette giorni, e i seguenti parametri sono valutati contemporaneamente: integrità barriera epiteliale, trasmigrazione macrofagi, sopravvivenza batterica, e infiammazione. Il presente protocollo descrive un sistema robusto e riproducibile per valutare l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite che potrebbe essere rilevante per scoprire nuovi anti-infettivi e ottimizzare la loro consegna di aerosol ai polmoni.

La figura 1A mostra la morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi dopo essere cresciuta sia per 24 h sul lato apicale che basolaterale dei supporti permeabili, rispettivamente. L'integrità della barriera epiteliale è dimostrata da TEER più alto (834 Ω-cm2) e CLSM da immunostaining per la proteina di giunzione stretta O-1 (Figura 1B). Gli stessi risultati osservati in termini di integrità barri...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Quindi, quando valutiamo nuovi anti-infettivi, dobbiamo affrontare due cose. Un lato sono i batteri. Se sono biofilm planctonici o informati, l'altro lato è la presenza di cellule ospiti, in particolare cellule ospiti epiteliali, che formano strette barriere biologiche.Se queste barriere vengono esistete, come potrebbe essere la risposta monologica, e con questo nuovo modello, possiamo effettivamente monitorare entrambi i parametri contemporaneamente. Quando si trattano infezioni batteriche, dobbiamo renderci conto di quale organo è influenzato. Ad esempio, se è il polmone, possiamo approfittarne e somministrare localmente il farmaco come aerosol.Tuttavia, se vogliamo avere un modello per studiare questo, abbiamo bisogno di un modello che consenta anche la posizione degli aerosol, come nel nostro modello. L'altro vantaggio è che si basa su cellule umane, in modo da poter evitare problemi dovuti a differenze tra animali e specie. Questo sistema potrebbe darti maggiori informazioni sul campo della ricerca sulle infezioni facendo luce sugli eventi molecolari e cellulari durante l'interazione di cellule ospiti e batteri.Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, ricordarsi di controllare il supporto cellulare per la sterilità e la morfologia cellulare e di fare attenzione quando si maneggiano i supporti permeabili. Coltivare CFBE41 O meno cellule in un pallone T 75 con mezzo essenziale minimo contenente 10%FCS, 1%amminoacidi non essenziali e 600 milligrammi per litro di glucosio a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Aggiungere un mezzo fresco alle celle ogni due o tre giorni.Dopo che le cellule hanno raggiunto il 70% di confluenza, lavarle con 10 millilitri di PBS e staccare con tre millilitri di EDTA di tripina a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere sette millilitri di MEM fresco e centrifugare le cellule a 300 volte G per quattro minuti. Dopo aver scartato il supernatante, a 10 millilitri di MEM, mentre si interrompono i grumi con una delicata pipettazione.Contare le cellule con un contatore di celle automatizzato o una camera emocitometrica, quindi diluirle a una concentrazione di 200.000 celle per 500 microlitri per la semina in 12 piastre di pozzo con supporti permeabili. Aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare per pozzo al lato apicale del supporto permeabile. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco al lato laterale basale.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. Il terzo giorno dopo la semina, creare un'interfaccia liquido ad aria rimuovendo il mezzo dal lato laterale basale prima poi dal lato apicale. Aggiungere 500 microlitri di MEM fresco sul lato laterale basale e cambiare il mezzo ogni secondo giorno fino a quando le cellule formano un monostrato confluente.Per valutare le proprietà della barriera epiteliale delle cellule, aggiungere 500 microlitri di mezzo cellulare al lato apicale e 1,5 millilitri sul lato laterale basale, quindi restituire la piastra all'incubatrice per un'ora. Misurare la resistenza elettrica del materiale di transito o TEER con elettrodo a bacchetta ann STX2 e un misuratore di volt epiteliale. Per coltivare le cellule THP1, coltivarle nel pallone T 75 utilizzando il mezzo RPMI 1640, integrato con il 10% di FCS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.Dividi le cellule ogni secondo giorno seminando 2 milioni di cellule per millilitro in un nuovo pallone T75. Per differenziare le cellule THP1, centrifugare il contenuto del pallone a 300 volte G per quattro minuti, scartare il supernatante. Resuspend il pellet in mezzo fresco e mettere in un nuovo pallone T75.Aggiungere 10 nanogrammi per millilitro PMA alle cellule e restituirle all'incubatrice. Per staccare il macrofago come cellule, lavarle una volta con PBS a 37 gradi Celsius e incubarle con tre millilitri di soluzione di distacco cellulare contenente EDTA millimolare 0,5 millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Verificare la presenza di distacco cellulare al microscopio invertito.Quando le cellule si sono staccate, aggiungere sette millilitri di mezzo fresco e centrifugarli a 300 volte G per quattro minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, rimescolare le cellule del macrofago in tre millilitri di mezzo THP1 in un tubo conico da 15 millilitri, contare le cellule e incubarle per un massimo di un'ora prima di impostare la co-coltura. Per stabilire una co-coltura epiteliale di macrofagi, rimuovere il mezzo dalla camera inferiore dei monostrati CFBE41 O meno e invertire attentamente il supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro sterile, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule ricoperte attraverso i pori della membrana.Posizionare 200.000 macrofagi THP1 in 200 microlitri di RPMI sul lato laterale basale dell'inserto invertito in ogni pozzo, chiudere le piastre di Petri e incubarle per due ore. Quindi riposizionare gli inserti nelle 12 micro piastre del pozzo e aggiungere 500 microlitri di mem medio al lato laterale basale dell'inserto permeabile. Inoculare 15 millilitri di lb integrati con 300 microgrammi per millilitro ampicillina con una singola colonia di P aeruginosa, PAO1GFP, incubare i batteri per 18 ore a 37 gradi Celsius, mentre tremano a 180 RPM.Dopo l'incubazione, trasferire i batteri in un tubo conico da 50 millilitri e centrifughe a 3.850 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 10 millilitri di PBS sterile che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius. Misurare la densità ottica a 600 nanometri e regolare la concentrazione di batteri con il mezzo di coltura cellulare fino a una concentrazione finale di 200.000 unità di formazione di colonie per millilitro, che corrisponde a una molteplicità di infezione di un batterio per cellula epiteliale.Aggiungere 100 microlitri di sospensione batterica al lato apicale del supporto permeabile e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora per consentire ai batteri di attaccarsi alle cellule, quindi rimuovere con cura il liquido apicale con una pipetta per ripristinare le condizioni ALI. Per gli esperimenti con il trattamento farmacologico, aggiungere 500 microlitri di una soluzione farmacologica diluita nel mezzo cellulare al lato apicale. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo cellulare al lato laterale basale.Raccogliere 500 microlitri del mezzo laterale atipico e basale e raggrupparli per valutare la CFU dei batteri non attaccati. Per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati o internalizzati, aggiungere 500 microlitri di acqua fredda sterile deionizzata ad ogni compartimento del supporto permeabile e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Se si valuta la CFU da campioni congelati, scongelarli a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi utilizzare punte di pipetta per raschiare la superficie della membrana facendo attenzione a non mettere troppa pressione sui pozzi. Pipetta su e giù per rimuovere tutti i contenuti aderenti. Con la sospensione batterica da entrambe le frazioni, effettuare una diluizione seriale da uno a 10 con interpolazione PBS e placcare i batteri su piastre di agar lb.Incubare le piastre di agar a 30 gradi Celsius per 16-72 ore, quindi contare le colonie e calcolare la CFU. La morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi sul lato laterale apicale e basilico dei supporti permeabili sono mostrati qui. Una maggiore misurazione teer e immunostaining per le proteine di giunzione stretta ZO1, ha dimostrato l'integrità della barriera epiteliale.Per modellare un'infezione batterica, P aeruginosa è stata inoculata su cellule CFBE41 o meno. I macrofagi sono stati osservati sul lato apicico della co-coltura sei ore dopo l'infezione. Il TEER è sceso a 250 ohm per centimetro al quadrato, indicando una barriera epiteliale compromessa, che è stata suggerita anche dalla colorazione ZO1.Qui viene mostrata la migrazione di macrofagi attraverso i pori filtranti permeabili e l'assorbimento batterico da parte delle cellule THP-1 sul lato apicali. Nelle monocolture THP-1, la migrazione dei macrofagi già un'ora dopo l'infezione. Nel frattempo la migrazione è stata vista dopo tre ore dopo l'infezione nella co-cultura.Le co-colture infette trattate con tobramicina per sei o 20 ore sono state immagini con microscopia laser a scansione confocale. Senza trattamento, le cellule epiteliali o i macrofagi sono morti dopo 20 ore di infezione. Nonostante sia stato visto dopo sei ore di trattamento nelle immagini della microscopia, un test CFU ha dimostrato che i batteri non proliferano.Tuttavia, i batteri hanno recuperato la loro capacità di proliferazione dopo il trattamento di 20 ore. Sono state inoltre misurate le teer delle monocolture e delle coculture. La co-coltura di cellule CFBE41 o meno con THP-1 non ha indotto alcun cambiamento nell'integrità della barriera epiteliale rispetto alla monocoltura.Al momento dell'infezione, il valore TEER è diminuito. quando si esegue questa procedura, è fondamentale assicurarsi che le cellule siano seduti correttamente e che la membrana del filtro non sia interrotta. Pertanto i passaggi di semina cellulare devono essere eseguiti con attenzione.Oltre a questo protocollo, la nebulizzazione degli antibiotici sugli inserti consentirebbe di vedere se la sopravvivenza dei batteri cambia rispetto alle condizioni sommerse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Determinazione degli acidi grassi tollerabile e Concentrazioni tossina colerica Uso Umano cellule epiteliali intestinali e BALB / c macrofagi del mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

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Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...