Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

この研究は、欧州連合(EU)のHORIZON 2020プログラムから、補助金契約第642028 H2028-MSCA-ITN-2014、NABBA - 生物学的障壁を克服し、重篤な疾患を治療するための高度なナノ医薬品の設計と開発に基づく研究、技術開発、デモンストレーションのための資金を受け取りました。アナ・コスタ博士とジェニー・ユントケ博士は、ELISAアッセイ、ペトラ・ケーニッヒ、ジャナ・ウェストヒュース、キアラ・デ・ロッシ博士の細胞培養、分析、顕微鏡コピーに関するサポートに対する科学的イラスト「アンジャ・ホーネッカー」に対する共文化の発展に大きな支援をしてくれたことに感謝します。また、原稿を校正してくれたチェルシー・ソーンに感謝します。

1. 透過性支持インサートにおける細胞の増殖と分化
<ol><li>CFBE41oを栽培- 10%胎児子牛血清(FCS)、1%非必須アミノ酸および5%CO2雰囲気を有する37°Cで600mg/Lグルコースを含む最小必須培地(MEM)の13 mLを有2するT75フラスコで。2~3日ごとに新鮮な培地を細胞に加えます。<ol>
<li>3 mLのトリプシン-エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)を37°Cで15分間、フラスコで70%合流した後、細胞を取り外しま?...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

本論文は、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41o-およびヒト単球由来マクロファージ細胞株THP-1によって構成される、感染した気道の3D共培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症の評価を可能にし、薬物の有効性と宿主応答を同時に検査する際の重要なパラメータである。モデルにおける新規?...

緑膿菌 は、肺組織障害に寄与する嚢胞性線維症(CF)に関連する病原体である。アルギン酸および他の粘液性エキソ多糖などの多糖類の生産は、粘り強い細菌の付着をもたらす疾患の進行を調整し、細菌への抗生物質の送達を制限し、宿主免疫系2に対して細菌を保護する。 P.緑素症 の段階からバイオフィルム形成への移行は、この文脈において重要な問題であり、また抗生物質耐性の発生を促進する。
CFのコンテキストでは、マウスは主にモデルとして使用されています。しかし、マウスはCF変異3の導入により、この疾患を自発的に発症しない。細菌バイオフィルムの開発および薬物感受性の研究のほとんどは、ペトリ皿などの生物的表面で行われてきた。ただし、この方法は in vivoの複雑さを表すものではありません。例えば、免疫細胞や粘膜上皮を含む重要な生物学的障壁は存在しない。P.緑素吸い道は上皮細胞に非常に有毒であるが、いくつかのグループは、ヒト気管支細胞と以前のP.緑素吸膜を共同培養することができました。これらの細胞は、CFTR突然変異を有する嚢胞性線維症患者(CFBE41o-細胞)4に由来し、抗生物質有効性5を評価するか、または感染時にCFTRタンパク質の補正を評価することを許可した6。-このようなモデルは、薬剤の有効性の予測可能性を向上させることが示されたが、薬剤開発の後の段階で失敗した薬物の問題の特徴付けを可能にすることに加えて7。
しかし、肺では、粘膜上皮が空気にさらされる。また、気道に存在する免疫細胞は、組織マクロファージのように、吸入病原体または粒子8に対して必須の役割を果たす。マクロファージは、気管支内腔に到達し、感染と戦うために異なる細胞層を介して移動します。さらに、吸入薬物はまた、肺空気・血液関門9の追加の非細胞元素としての粘液の存在に対処しなければならない。実際、インビボの関連性を高め、いくつかの複雑な3次元(3D)インビトロモデルが開発されました。共培養システムは、創薬のためのin vitroシステムの複雑さを高めるだけでなく、細胞と細胞の相互作用を研究することを可能にします。このような複雑さは、マクロファージ遊走10に関する研究において取り組み、好中球11による抗菌ペプチドの放出、感染における粘液の役割9、及び上皮細胞反応を過剰損傷12に対する。しかし、CFの遺伝子変異を特徴とする信頼性の高いCF感染型インビトロモデルは、空気にさらされ(生理学的状態が増加する)、免疫細胞を統合することは依然として欠けている。
このギャップを埋めるために、我々は、感染した気道の安定したヒト3D共培養のためのプロトコルを記述する。このモデルは、ヒトCF気管支上皮細胞およびマクロファージで構成され、P.緑内膜に感染し、拡散性および免疫学的障壁の両方を表すことができる。合理的に高いスループットで抗感染薬をテストするという目標を持つこの共培養は、2つのヒト細胞株CFBE41oとTHP-1単球由来マクロファージを使用して、-ウェルプレートインサートの透過性フィルター膜に確立されました。さらに、最終的にエアロゾル化抗感染剤13の沈着を研究するために、このモデルは液体被覆条件(LCC)ではなく空気液体界面(ALI)で確立された。
ここで報告するように、このモデルは、抗生物質治療時の細菌生存期間だけでなく、細胞毒性、上皮バリア完全性、マクロファージ転移、および薬物開発に不可欠な炎症反応を評価することを可能にする。
このプロトコルは、肺気道の吸入療法のための2つの関連する細胞タイプを組み合わせた:マクロファージとCF気管支上皮。これらの細胞は、透過性支持口の反対側に播種され、空気への細胞暴露を可能にする(空気/液体界面(ALI)条件と呼ばれる)。この宿主細胞の共培養は、その後、P.緑素吸い星に感染する。両方の宿主細胞株はヒト由来である:上皮細胞は嚢胞性線維症気管支上皮を表し、CFチャネル(CFBE41o-)に変異を有-し、THP-11414細胞は、よく特徴付けられたマクロファージ様細胞株である。コンフルエント上皮層は、マクロファージ様細胞が反対側のコンパートメントに加える前に、まずウェルプレート挿入物の上側に形成される。ALIで共培養が確立されると、システムは、アプリーカル側のP.緑素吸着で接種されます。この感染した共培養システムは、例えばトブラマイシンなどの抗生物質の有効性を評価するために使用される。次のエンドポイントを分析する:経上皮電気抵抗(TEER)の点で上皮バリア完全性、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による細胞細胞および細胞細菌相互作用の可視化、コロニー形成単位(CFU)のカウントによる細菌生存、宿主細胞生存(細胞毒性)およびサイトカイン放出。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

肺感染症の治療のためのfDrug研究は、高い複雑さのイン ビトロ モデルの予測に向かって進んでいます。肺モデルにおける細菌の多面的存在は上皮配列を再適応させることができ、免疫細胞は微小環境における細菌に対する炎症反応を調整する。 生体内 モデルは嚢胞性線維症の文脈で新しい抗感染薬をテストするための選択であったが、彼らはまだヒトにおけるそのような疾患の インビボ 状態および治療結果を正確に模倣していない。ヒト細胞(気管支上皮およびマクロファージ)および関連する病原体に基づく感染気道の複雑な in vitro モデルは、このギャップを埋め、新しい抗感染薬のクリニックへの翻訳を容易にする可能性がある。このような目的のために、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41oと THP-1単球由来マクロファージの共培養モデルが確立され、空気液体界面(ALI)状態における 緑化 症によるヒト気管支粘膜の感染を模倣した。このモデルは7日間で設定され、次のパラメータが同時に評価されます:上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症。本プロトコルは、新しい抗感染薬の発見と肺へのエアロゾル送達の最適化に関連する可能性のある薬物有効性および宿主応答を評価するための堅牢で再現可能なシステムを記述する。

図1A は、それぞれ、透過性支持体の頂部側およびバソラショナル側で24時間成長した後のヒト気管支上皮細胞とマクロファージの共培養の形態を示す。上皮バリア完全性は、より高いTEER(834Ω×cm2)およびCLSMにより、密接結合タンパク質ZO-1に対する免疫染色によって示される(図1B)。感染していないCFBE41oのバリア完全性の観点から観察された?...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面-で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

だから、新しい抗感染薬を評価しているとき、私たちは2つのことに取り組まなければなりません。片側は細菌です。彼らがプランクトニックまたは情報に基づいたバイオフィルムである場合、反対側は、狭い生物学的障壁を形成する宿主細胞、特に上皮宿主細胞の存在である。これらのバリアが影響を受け、単一応答がどのようになっている可能性があり、この新しいモデルでは、実際に両方のパラメータを同時に監視できます。細菌感染を治療する際には、どのような臓器が影響を受けているかを認識する必要があります。例えば、肺であれば、それを利用し、薬をエアロゾルとして局所的に投与することができます。しかし、これを研究するためのモデルを持ちたい場合は、モデルに当てはまるエアロゾルの位置も可能にするモデルが必要です。もう一つの利点は、それが人間の細胞に基づいているので、動物や種の違いによる問題を避けることができます。このシステムは、宿主細胞と細菌の相互作用の間に分子および細胞事象に光を当てることによって、感染研究の分野に関するより多くの洞察を与えることができる。初めてこのプロトコルを試みるとき、細胞媒体の無菌性および細胞形態を確認し、透過性支持体を扱う際には注意してください。10%FCS、1%の非必須アミノ酸、および5%の二酸化炭素で摂氏37度で1リットル当たり600ミリグラムの最低必須培地を含むT 75フラスコでCFBE41 Oマイナス細胞を培養します。2~3日ごとに新鮮な培地を細胞に加えます。細胞が70%の合流度に達した後、PBSの10ミリリットルでそれらを洗浄し、15分間摂氏37度で3ミリリットルのトリプシンEDTAで取り外します。その後、新鮮なMEMを7ミリリットル加え、Gの300倍の細胞を4分間遠心分離します。上清を捨て、MEMの10ミリリットルで廃棄した後、穏やかなピペットで塊を破壊しながら。自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターチャンバーで細胞を数え、透過性支持体を備えた12ウェルプレートに播種するために、500マイクロリットルあたり200,000細胞の濃度に希釈します。透過性支持体の補助側にウェルあたり500マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。その後、基底側側に新鮮な培地の1.5ミリリットルを追加します。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間インキュベートします。播種後3日目に、まず底底側側から媒体を取り除き、次に、空気液体界面を、次に、天側から取り出して、空気液体界面を作成します。500マイクロリットルの新鮮なMEMを基底側側に加え、細胞がコンフルエント単層を形成するまで2日ごとに培地を交換します。細胞の上皮バリア特性を評価するには、500マイクロリットルの細胞培地を補助側に加え、基底側側に1.5ミリリットルを加え、プレートを1時間インキュベーターに戻した。輸送材料電気抵抗またはTEERをアンSTX2箸電極および上皮ボルトオームメーターで測定する。THP1細胞を培養するには、RPMI 1640培地を用いてT75フラスコで増殖させ、摂氏37度で10%FCS、炭酸ガス5%を補給する。新しいT75フラスコに1ミリリットル当たり200万個の細胞を播種して、2日ごとに細胞を分割します。THP1細胞を分化するために、フラスコの内容物をGの300倍に4分間遠心し、上清を捨てる。新鮮な培地でペレットを再び懸濁し、新しいT75フラスコに入れます。細胞に1ミリリットルPMAあたり10ナノグラムを加え、インキュベーターに戻します。マクロファージのように細胞を取り外すには、PBSで1回37°Cで洗浄し、室温で10分間0.5ミリモルEDTAを含む3ミリリットルの細胞剥離液でインキュベートします。逆顕微鏡で細胞剥離を確認します。細胞が剥離したら、新鮮な培地を7ミリリットル加え、Gの300倍に4分間遠心分離します。上清を除去した後、マクロファージ細胞を15ミリリットルの円錐チューブ内のTHP1培地の3ミリリットルで再懸濁し、細胞を数え、同時培養を設定する前に最大1時間インキュベートする。上皮マクロファージの共培養を確立するには、CFBE41 Oから単層を引いた下の部屋から培地を取り除き、滅菌ガラスペトリ皿の中で支持体を慎重に反転させ、細胞スクレーパーを使用して膜細孔を介して生育した細胞を除去する。各ウェルの逆インサートの基底側側にRPMIの200,000のTHP1マクロファージを置き、ペトリ皿を閉じて2時間インキュベートします。その後、12ウェルマイクロプレートに挿入物を戻し、透過性インサートの基底側側にMEM培地の500マイクロリットルを追加します。P緑素吸塩、PAO1GFPの単一コロニーでミリリットルアンピシリンあたり300マイクログラムを加えたlbの15ミリリットルを接種し、180 RPMで振りながら、摂氏37度で18時間細菌をインキュベートする。インキュベーション後、細菌を50ミリリットル円錐形チューブに移し、遠心分離機を3,850倍Gで5分間移動する。上清を捨て、摂氏37度に予熱した無菌PBSを10ミリリットル加えます。600ナノメートルで光学濃度を測定し、上皮細胞当たり1つの細菌の感染の多重性に対応する1ミリリットル当たり200,000コロニー形成単位の最終濃度に細胞培養培地を用いた細菌の濃度を調整する。透過性支持体の補助側に100マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、プレートを摂氏37度でインキュベートし、1時間5%の二酸化炭素をインキュベートして細菌を細胞に取り付け、ピペットでピペットで慎重に取り除き、ALIの状態を回復させます。薬物治療の実験では、細胞培地で希釈した薬物溶液500マイクロリットルをアプリカル側に加える。その後、基底側側に1.5ミリリットルの細胞培地を加えます。非定型および基底横の媒体の500マイクロリットルを集め、非付着細菌のCFUを査定するためにそれらをプールする。付属または内在化された細菌の生存を評価するには、透過性支持体の各区画に500マイクロリットルの無菌脱イオン冷水を加え、室温で30分間細胞をインキュベートする。凍結サンプルからCFUを評価する場合は、摂氏37度で10分間解凍します。その後、ピペットの先端を使用して、井戸にあまりにも多くの圧力をかけないように注意して膜表面を削ります。ピペットは、すべての付着コンテンツを削除するために上下.両方の分画から細菌の懸濁液で、PBSトゥイーンで1〜10シリアル希釈を行い、lb寒天プレートに細菌をプレートします。寒天プレートを摂氏30度で16~72時間インキュベートし、コロニーを数えてCFUを計算します。透過性支持体の頭蓋側側およびバジル側側にヒト気管支上皮細胞とマクロファージの結果として生じる共培養の形態をここに示す。密接結合タンパク質ZO1に対する高いTEER測定および免疫染色により、上皮バリア完全性が証明された。細菌感染をモデル化するために、P緑分化はCFBE41 oマイナス細胞に接種した。マクロファージは、感染の6時間後に共培養の有端側で観察された。TEERは250オームセンチメートル平方メートルに低下し、ZO1染色によっても示唆された侵害された上皮障壁を示す。この図に、アピカル側のTHP-1細胞による透過性フィルター細孔および細菌取り込みを介したマクロファージトランスマイグレーションが示されている。THP-1単一培養では、感染後早くも1時間のマクロファージ移行が行われている。一方、共同培養で感染後3時間後に移行が見られた。トブラマイシンで6時間または20時間治療した感染した共培養物を、共焦点走査レーザー顕微鏡で画像化した。治療を行わない場合、上皮細胞またはマクロファージのいずれかが20時間の感染後に死亡した。顕微鏡写真で6時間の治療の後に見られたにもかかわらず、CFUアッセイは細菌が増殖しないことを実証した。それにもかかわらず、細菌は20時間の治療後に増殖能力を回復した。単一培養および共培養のTEERも測定した。CFBE41 oマイナス細胞の共培養は、単一培養と比較して上皮バリア完全性の変化を誘発しなかった。感染時に、TEER値が低下した。この手順を実行する場合、細胞が適切に座っており、フィルター膜が破壊されていないことを確認することが重要です。したがって、細胞の播種手順は慎重に行う必要があります。このプロトコルに加えて、インサート上の抗生物質のネビュライゼーションは、細菌の生存率が水中条件と比較して変化しているかどうかを確認することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

P. アフルギノーサ抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー