Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

이 작품은 유럽 연합의 HORIZON 2020 연구, 기술 개발 및 보조금 협정에 따른 데모 프로그램 642020-MSCA-ITN-2014, NABBA - 생물학적 장벽을 극복하고 심각한 질병을 치료하기 위한 첨단 나노의약품의 설계 및 개발에서 자금을 지원받았습니다. 우리는 아나 코스타 박사와 제니 Juntke 박사에게 공동 문화 개발에 큰 지원을 주셔서 감사합니다, 올가 하트비히, 과학 적인 삽화에 대한, 안자 Honecker, ELISA 분석, 페트라 쾨니히, 야나 웨스트 휴스와 박사 키아라 드 로시 세포 문화, 분석, 현미경 검사법에 대한 지원. 우리는 또한 우리의 원고를 교정 첼시 손 에게 감사드립니다.

1. 투과성 지원 인서치에서 세포의 성장과 분화
<ol><li>CFBE41o 재배- 10% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 최소 필수 배지(MEM)의 13mL을 함유한 T75 플라스크에서, 1% 비필수 아미노산과 600 mg/L 포도당에서 37°C에서 5%CO2 분위기를 이룬다. 2-3일마다 셀에 신선한 배지를 추가합니다.<ol>
<li>플라스크에서 70% 합류한 후 3mL의 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 15분 동안 37°C로 분리한다...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

본 논문은 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및 인간 단핵세포세포주 THP-1에 의해 구성된 감염된 기도의 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 약물 효능 및 숙주 반응을 동시에 테스트할 때 중요한 매개 변수인 상피 장벽 무결성, 대식세포 변형, 박테리아 생존 및 염증의 평가를 허용합니다. 모델의 참신은 급성 세균 감염(즉, Aeruginosa)을가진 상피 세포(즉, 인...

슈도모나스 아에루기노사는 낭포성 섬유증(CF)의 관련 병원체로 폐 조직 장애1에기여한다. 알자네이트 및 기타 점액 외극성 과 같은 다당류의 생산은, 끈질긴 세균 준수로 이끌어 내는 질병의 진행을 조정하고, 박테리아에 대한 항생제의 전달을 제한하고 숙주 면역 계통에 대하여 박테리아를 보호합니다2. 판자에서 생물막 형성으로의 P. aeruginosa의 전환은 이러한 맥락에서 중요한 문제이며, 또한 항생제 내성의 발생을 용이하게합니다.
CF의 맥락에서 마우스는 주로 모델로 사용되었습니다. 마우스는, 그러나, CF 돌연변이3의도입과 함께 자발적으로 이 질병을 개발하지 않는다. 대부분의 세균성 생물막 개발 및 약물 감수성 연구는 페트리 접시와 같은 무생물 표면에서 수행되었습니다. 그러나 이 방법은 생체 내 복잡성을 나타내지는 않습니다. 예를 들면, 중요한 생물학 장벽은 면역 세포 뿐만 아니라 점막 상피를 포함하여 결석합니다. P. aeruginosa는 상피 세포에 아주 유독하더라도, 몇몇 단은 인간 기관지 세포와 이전 P. aeruginosa 생물막을 공동 경작하는 것을 관리했습니다. 이들 세포는 CFTR 돌연변이(CFBE41o-세포)를 가진- 낭포성4 섬유증 환자로부터 유래하고 항생제 효능5을 평가하거나 감염6시 CFTR 단백질의 교정을 평가할 수 있었다. 이러한 모델은 약물 개발7의 후기 단계에서 실패한 약물문제의 특성화를 가능하게 하는 것 외에도 약물 효능의7예측 가능성을 향상시키는 것으로 나타났다.
그러나 폐에서는 점막 상피가 공기에 노출됩니다. 더욱이, 기도에 존재하는 면역 세포는 조직 대식세포같이, 흡입한 병원체 또는 입자에 대하여 필수적인 역할을합니다 8. 대식세포는 기관지 루멘에 도달하고 감염을 싸우기 위하여 다른 세포 층을 통해 이동합니다. 더욱이, 흡입된 약은 또한 폐 공기-혈액 장벽9의추가 비세포 원소로서 점액의 존재에 대처해야 한다. 실제로 생체 외 모델의 복잡한 3차원(3D)이 개발되어 생체 내 관련성을 높이는 것을 목표로 하고 있다. 공동 배양 시스템은 약물 발견을 위한 체외 시스템의 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다. 이러한 복잡성은 대식세포이동(10),호중구(11)에의한 항균 펩티드의 방출, 감염9에서점액의 역할, 및 과도한손상(12)에대한 상피 세포 반응에 대한 연구에서 해결되었다. 그러나, CF의 유전돌연변이를 특징으로 하는 신뢰할 수 있는 CF-감염 체외 모델, 공기에 노출되는 (생리학적 상태 증가), 면역 세포를 통합하는 것은 여전히 부족하다.
이 격차를 해소하기 위해 감염된 기도의 안정적인 인간 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 P. aeruginosa에 감염되고 확산 및 면역 학적 장벽을 모두 나타내는 인간 CF 기관지 상피 세포 및 대식세포의 구성이다. 합리적으로 높은 처리량에서 항 감염제를 테스트하는 것을 목표로, 이 공동 배양은 두 개의 인간 세포주를 사용하여 웰 플레이트 인서트의 투과성 필터 멤브레인에 설립되었습니다: CFBE41o- 및 THP-1 단백세포 유래 대식세포. 더욱이, 결국 에어로졸화항감염제(13)의증착을 연구하기 위해, 이 모델은 액체 가루 조건(LCC)이 아닌 공기-액체 인터페이스(ALI)에 확립되었다.
우리가 여기에서 보고하는 바와 같이, 이 모형은 약 발달을 위한 필수적인 매개 변수인 항생 처리에 세균성 생존뿐 아니라 세포 세포 독성, 상피 장벽 무결성, 대식세포 변환 및 선동적인 반응에 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜은 폐기도의 흡입 치료를 위한 두 가지 관련 세포 유형을 결합합니다: 대식세포및 CF 기관지 상피. 이 세포는 투과성 지지 인서트의 반대쪽에 시드되어 공기에 세포 노출을 허용합니다(공기-액체 인터페이스(ALI) 조건이라고 합니다. 숙주 세포의 이러한 공동 배양은 이후에 P. aeruginosa에감염된다. 두 숙주 세포주 모두 인간 기원입니다: 상피 세포는 CF 채널(CFBE41o-)에 돌연변이를 가진 낭포성-섬유증 기관지 상피를 나타내며, THP-114 세포는 잘 특징적인 대식세포와 같은 세포주이다. 동천상피층은 대식세포와 같은 세포가 반대 구획에 추가되기 전에 웰 플레이트 인서츠의 상부에 형성될 수 있게 된다. ALI에서 공동 문화가 확립되면, 시스템은 apical 측에 P. aeruginosa와 접종된다. 이 감염된 공동 배양 시스템은 항생제, 예를 들어 토브라마이신의 효능을 평가하기 위해 사용됩니다. 다음 종점은 분석된다: 상피 방벽 무결성 경피성 전기 저항 (TEER), 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 의한 세포 세포 및 세포 박테리아 상호 작용의 시각화), 식민지 형성 단위 (CFU), 숙주 세포 생존 (세포 독성) 및 사이토카인 방출의 계산에 의한 세균 생존.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

f폐감염의 치료를 위한 약물 연구는 높은 복잡성의 시험관 내 모델을 향해 진행되고 있다. 폐 모형에 있는 박테리아의 다각적인 존재는 면역 세포가 마이크로 환경에서 박테리아에 대하여 선동적인 반응을 조정하는 동안 상피 배열을 재적응할 수 있습니다. 생체 내 모델은 낭포성 섬유증의 맥락에서 새로운 항 감염제를 테스트하기위한 선택이지만, 그들은 여전히 인간과 치료 결과에 그러한 질병의 생체 내 상태를 정확하게 모방하지 않습니다. 인간 세포 (기관지 상피 및 대식세포)와 관련 병원체에 기초한 감염된 기도의 복잡한 시험관 내 모형은 이 간격을 다리를 내고 진료소로 새로운 항 감염제의 번역을 용이하게 할 수 있었습니다. 이러한 목적을 위해, 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및- THP-1 단낭세포 유래 대식세포의 공동 배양 모델이 설립되어 공기 액체 인터페이스(ALI) 조건에서 P. aeruginosa에 의한 인간 기관지 점막의 감염을 모방하였다. 이 모델은 7 일 안에 설정되며, 다음과 같은 매개 변수는 동시에 평가됩니다 : 상피 장벽 무결성, 대식 세포 간 변형, 세균 생존 및 염증. 본 프로토콜은 새로운 항 감염제를 발견하고 폐에 에어로졸 납품을 최적화하는 것과 관련이 있을 수 있는 약물 효능 및 호스트 반응을 평가하기 위한 견고하고 재현 가능한 시스템을 설명합니다.

도 1A는 투과성 지지의 정맥 및 바소포측에서 24시간 동안 모두 성장한 후 인간 기관지 상피 세포 및 대식세포의 결과공동배양체의 형태를 각각 나타낸다. 상피 장벽 무결성은 단단한 접합 단백질 ZO-1(도 1B)에대한 면역 염색에 의해 더 높은 TEER (834 Ω × cm2)및 CLSM에 의해 표시됩니다. 감염되지 않은 CFBE41o의 장벽 무결성 측면에서 관찰된 동일한<sup...

Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

그래서 우리는 새로운 항 감염제를 평가할 때 두 가지를 해결해야 합니다. 한쪽은 박테리아입니다. 그들은 판자 또는 통보 된 생물 막 인 경우, 다른 쪽은 호스트 세포의 존재, 특히 상피 숙주 세포, 꽉 생물학적 장벽을 형성.이러한 장벽이 적용되면, 어떻게 생물학적 반응이 이루어질 수 있는지, 그리고 이 새로운 모델을 사용하면 실제로 두 매개 변수를 동시에 모니터링할 수 있습니다. 세균성 감염을 취급할 때, 우리는 어떤 기관이 영향을 받는지 깨워야 합니다. 예를 들어, 폐인 경우, 우리는 이점을 활용할 수 있으며, 에어로졸로 약물을 토폴로 투여할 수 있습니다.그러나, 우리는이 연구를위한 모델을 갖고 싶은 경우에, 우리는 또한 우리의 모델의 경우 에어로졸의 위치를 허용하는 모델이 필요합니다. 또 다른 장점은 인간 세포를 기반으로 하여 동물과 종의 차이로 인한 문제를 피할 수 있다는 것입니다. 이 시스템은 숙주 세포와 박테리아의 상호 작용 도중 분자 및 세포 사건에 빛을 흘리기 위하여 감염 연구의 필드에 더 많은 통찰력을 줄 수 있었습니다.이 프로토콜을 처음으로 시도할 때, 세포 배지에서 멸균 및 세포 형태학을 확인하고 투과성 지지대를 처리할 때 주의해야 합니다. 10%FCS, 1%비필수 아미노산, 리터당 600밀리그램의 이산화탄소 5%를 함유한 최소 필수 배지로 CFBE41 O 마이너스 세포를 육성합니다. 2~3일마다 셀에 신선한 배지를 추가합니다.세포가 70%의 합류에 도달한 후, PBS 10밀리리터로 씻어내고 15분 동안 섭씨 37도에서 트립신 EDTA 3밀리리터로 분리합니다. 그런 다음 7 밀리리터의 신선한 MEM을 추가하고 세포를 300배 G에서 4분 동안 원심분리합니다. 상체를 폐기 한 후, MEM의 10 밀리리터에서 부드러운 파이펫으로 덩어리를 방해합니다.자동 세포 카운터 또는 혈혈계 챔버를 가진 세포를 계산한 다음 투과성 지지체가있는 12 개의 웰 플레이트에서 파종하기 위해 500 마이크로 리터 당 200, 000 세포의 농도로 희석하십시오. 투과성 지지의 정점에 잘 셀 서스펜션 500마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 신선한 배지를 기초 측에 추가합니다.세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 배양합니다. 파종 후 셋째 날에는 기저 측에서 배지를 제거한 다음 정액 측에서 공기 액체 인터페이스를 만듭니다. 500 마이크로리터의 신선한 MEM을 기초 측에 추가하고 세포가 컨리치 모노레이어를 형성할 때까지 매2일마다 배지를 변경합니다.세포의 상피 장벽 특성을 평가하기 위해, 정측에 세포 배지의 500 마이크로리터를 추가하고, 1.5 밀리리터를 기저측에 추가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 1시간 동안 반납하였다. 탄 STX2 젓가락 전극과 상피 볼트 옴 미터로 운송 재료 전기 저항 또는 TEER를 측정합니다. THP1 세포를 재배하려면 RPMI 1640 배지를 사용하여 T 75 플라스크에서 성장하여 섭씨 37도에서 10%FCS와 이산화탄소 5%로 보충합니다.새로운 T75 플라스크에서 밀리리터당 2백만 개의 세포를 시드하여 매일 세포를 분할합니다. THP1 세포를 분화하기 위해 플라스크의 내용을 300배 G에서 4분간 원심분리하고, 상퍼를 폐기한다. 신선한 매체에 펠릿을 다시 중단하고 새로운 T75 플라스크에 넣습니다.세포에 밀리리터 PMA 당 10 나노그램을 추가하고 인큐베이터에 반환합니다. 세포와 같은 대식세포를 분리하려면 PBS로 한 번 씻고 실온에서 0.5 밀리머 EDTA를 포함하는 세포 분리 용액 3 밀리리터로 인큐베이션하십시오. 반전된 현미경의 밑에 세포 분리를 확인하십시오.세포가 분리되면 신선한 중간 크기의 7 밀리리터를 넣고 원심분리기를 4분 동안 300배 G로 추가합니다. 상체를 제거한 후, 15밀리리터 원뿔관에서 THP1 배지의 3밀리리터에서 대식세포 세포를 재보중단하고, 세포를 계산하고, 공동 배양을 설정하기 전에 최대 1시간 동안 배양한다. 상피 대식세포 공동 배양을 확립하기 위해 CFBE41 O 의 하부 챔버에서 배지를 제거하고 멸균 유리 페트리 접시 내부의 지지도를 신중하게 반전시키고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 막 모공을 통해 자란 세포를 제거한다.200, 000 THP1 대식세포는 각 우물에 반전 된 인서트의 기저 측에 RPMI의 200 마이크로 리터에 배치, 페트리 접시를 닫고, 두 시간 동안 배양. 그런 다음 인서트를 12개의 마이크로 플레이트에 다시 넣고 침투성 인서치의 기저 측에 500마이크로리터의 MEM 배지를 추가합니다. 15 밀리리터의 접종을 180 RPM에서 흔들면서 180°C에서 18시간 동안 박테리아를 37도에서 18시간 동안 배양한 페아루기노사(PaO1GFP)의 단일 콜로니콜로 밀리리터 암피실린 당 300 마이크로그램으로 보충하였다.인큐베이션 후, 50 밀리리터 원원형 튜브로 박테리아를 옮기고, 원심분리기는 5분 동안 3, 850회 G로 옮긴다. 상체를 버리고 섭씨 37도에 예열된 멸균 PBS 10 밀리리터를 추가합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 상피 세포 당 하나의 박테리아의 감염의 복합성에 해당하는 밀리리터 당 200, 000 콜로니 형성 단위의 최종 농도로 세포 배양 배지와 박테리아의 농도를 조정합니다.투과성 지지의 정점에 세균 현탁액 100마이크로리터를 추가하고 박테리아가 세포에 부착할 수 있도록 1시간 동안 37도, 이산화탄소 5%에서 플레이트를 배양한 다음, 파이펫으로 압정 액체를 조심스럽게 제거하여 ALI 조건을 복원합니다. 약물 치료를 위한 실험을 위해 세포 배지에서 희석된 약물 용액 500마이크로리터를 apical 측에 추가합니다. 그런 다음 기저 측에 세포 배지 1.5 밀리리터를 추가합니다.비정형 및 기저 측량 배지의 500 마이크로리터를 수집하고 비 부착 된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 그들을 풀. 부착 또는 내부화 박테리아의 생존을 평가하기 위해, 투과성 지지의 각 구획에 멸균 제열된 차가운 물의 500 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 세포를 배양한다. 냉동 샘플에서 CFU를 평가하는 경우 섭씨 37도에서 10분 동안 해동하십시오.그런 다음 파이펫 팁을 사용하여 우물에 너무 많은 압력을 가하지 않도록주의하여 멤브레인 표면을 긁어 냅니다. 파이펫을 위아래로 위로 하여 부착된 모든 콘텐츠를 제거합니다. 두 분획에서 세균 현탁액으로, PBS tween와 1 ~ 10 시리얼 희석을 하고 lb agar 접시에 박테리아를 플레이트.16~72시간 동안 30도의 한천 판을 배양한 다음 식민지를 계산하고 CFU를 계산합니다. 투과성 지지의 정맥 및 바질 측에 인간 기관지 상피 세포 및 대식세포의 결과 공동 배양의 형태는 여기에 도시된다. 단단한 접합 단백질 ZO1에 대한 더 높은 TEER 측정 및 면역 염색은 상피 장벽 무결성을 입증했습니다.세균감염을 모델링하기 위해, P aeruginosa는 CFBE41 o 마이너스 세포에 접종하였다. 대식세포는 감염 후 6시간 후 공동배시의 정량면에서 관찰되었다. TEER는 섭미터 곱250ohm로 떨어졌으며, 이는 ZO1 염색에 의해 제안된 손상된 상피 장벽을 나타냅니다.대식세포 트랜스 이동은 투과성 필터 모공 및 박테리아 통풍구를 통해 APICAL 측에 THP-1 세포에 의해 여기에 도시된다. THP-1 단배기에서는, 대식세포 이주가 감염 후 1시간 부터 이른 시동한다. 한편 이주는 공동 배양에서 3시간 후 감염 후 보였다.6 또는 20 시간 동안 토브라마이신으로 처리 된 감염된 공동 배양은 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 이미지화되었다. 치료없이 상피 세포 또는 대식세포는 감염 20 시간 후에 사망했습니다. 현미경 사진에서 6 시간의 치료 후 볼 수 있음에도 불구하고 CFU 분석은 박테리아가 증식하지 않았다는 것을 입증했습니다.그럼에도 불구 하 고, 박테리아는 20 시간 치료 후 그들의 확산 능력을 회복. 단일 문화와 공동 문화의 TEER도 측정되었다. THP-1을 가진 CFBE41 o 마이너스 세포의 공동 배양은 단배문화에 비해 상피 장벽 무결성에 있는 어떤 변경도 유도하지 않았다.감염 시 TEER 값이 떨어졌습니다. 이 절차를 수행할 때 세포가 제대로 앉아 있고 필터 멤브레인이 중단되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 셀 시드 단계는 신중하게 수행해야 합니다.이 프로토콜 이외에, 삽입에 항생제의 분기는 박테리아 생존이 잠수 조건에 비해 변경되는지 확인하는 가능하게 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

인간의 장내 상피 세포와 BALB / C 마우스 대 식세포를 사용하여 웬만한 지방산과 콜레라 독소 농도의 결정

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...