Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Dette arbeidet fikk støtte fra EUs HORIZON 2020-program for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon i henhold til tilskuddsavtale nr. Vi takker Dr. Ana Costa og Dr. Jenny Juntke for den store støtten til utviklingen av medkulturen, Olga Hartwig, for den vitenskapelige illustrasjonen, Anja Honecker, for ELISA-analyser, Petra König, Jana Westhues og Dr. Chiara De Rossi for støtte til cellekultur, analyse og mikroskopi. Vi takker også Chelsea Thorn for korrekturlesing av manuskriptet vårt.

1. Vekst og differensiering av celler i gjennomtrengelige støtteinnlegg
<ol><li>Dyrk CFBE41o- i en T75 kolbe med 13 ml minimum essensiell medium (MEM) som inneholder 10% fosterkalvserum (FCS), 1% ikke-essensielle aminosyrer og 600 mg / l glukose ved 37 ° C med 5 % CO2 atmosfære. Tilsett friskt medium til cellene hver 2–3.<ol>
<li>Løsne cellene etter å ha nådd 70% samløpet i kolben med 3 ml trypsin- Etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) ved 37 °C i 15 min. Tilsett 7 ml fersk MEM og sentrif...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+and+host+immunity+to+infection.">Lung dendritic cells and host immunity to infection.</a> European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).</li><li>Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. A., Schulze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+Vaccine+Adjuvant+System+Alum/c-di-AMP+Results+in+Quantitative+and+Qualitative+Enhanced+Immune+Responses+Post+Immunization.">The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).</li><li>Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+selective+autophagy-induction+rescues+&#948;F508-CFTR+and+inhibits+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+cystic+fibrosis.">Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues &#948;F508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis.</a> PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).</li><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Dette papiret beskriver en protokoll for en 3D-co-kultur av de infiserte luftveiene, som utgjøres av den menneskelige cystiske fibrose bronkial epitelcellelinjen CFBE41o- og den menneskelige monocyttavledede makrofagcellelinjen THP-1. Protokollen tillater vurdering av epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon, bakterieoverlevelse og betennelse, som er viktige parametere ved testing av legemiddeleffektivitet og vertsrespons samtidig. Nyheten i modellen ligger innenfor inkorporering av epitelceller (det vil vil vil...

Pseudomonas aeruginosa er et relevant patogen i cystisk fibrose (CF) som bidrar til nedsatt lungevev1. Produksjonen av polysakkarider, som alginat og andre mucoid eksopolysakkarider, koordinerer sykdomsprogresjonen, noe som fører til seig bakteriell etterlevelse, begrenser levering av antibiotika til bakterier og beskytter bakteriene mot vertsufmunsystemet2. Overgangen av P. aeruginosa fra planktonisk stadium til biofilmdannelse er et kritisk problem i denne sammenhengen, og legger også til rette for forekomsten av antibiotikatoleranse.
I sammenheng med CF har musen primært blitt brukt som modell. Mus utvikler imidlertid ikke spontant denne sykdommen ved innføring av CF-mutasjoner3. De fleste bakterielle biofilmutvikling og legemiddelfølsomhetsstudier har blitt utført på abiotiske overflater, for eksempel Petri-retter. Denne tilnærmingen representerer imidlertid ikke in vivo-kompleksiteten. For eksempel er viktige biologiske barrierer fraværende, inkludert immunceller samt slimhinneepitelet. Selv om P. aeruginosa er ganske giftig for epitelceller, har noen grupper klart å dyrke en tidligere P. aeruginosa biofilm med menneskelige bronkialceller. Disse cellene stammer fra cystisk fibrose pasienter med CFTR mutasjon (CFBE41o- celler)4 og lov til å vurdere antibiotikaeffekt 5 eller vurdere korreksjon av CFTR protein underinfeksjon 6. En slik modell ble vist å forbedre forutsigbarheten av legemiddeleffekt, i tillegg til å muliggjøre karakterisering av problemer med legemidler som mislyktes i senere faser av narkotikautvikling7.
Men i lungene er slimhinneepitelet utsatt for luft. Videre spiller immunceller tilstede i luftveiene, som vevmakrofager, en viktig rolle mot inhalerte patogener eller partikler8. Makrofager migrerer gjennom de forskjellige cellelagene for å nå bronkial lumen og bekjempe infeksjonen. Videre må inhalerte legemidler også takle tilstedeværelsen av slim som et ekstra ikke-cellulært element i lungeluftblodbarrieren9. Faktisk er det utviklet flere komplekse tredimensjonale (3D) in vitro-modeller, med sikte på å øke in vivo relevansen. Co-kultur systemer ikke bare øke kompleksiteten i in vitro systemer for narkotika oppdagelse, men også gjøre det mulig å studere celle-celle interaksjoner. Slik kompleksitet har blitt adressert i studier om makrofagmigrasjon10, frigjøring av antimikrobielle peptider av nøytrofiler11, rollen som slim i infeksjon9, og epitelcellereaksjonen på overdreven skade12. Men en pålitelig CF-infisert in vitro-modell som har den genetiske mutasjonen i CF, som er utsatt for luften (økt fysiologisk tilstand), og integrerer immunceller mangler fortsatt.
For å bygge bro over dette gapet beskriver vi en protokoll for stabil menneskelig 3D-co-kultur i de infiserte luftveiene. Modellen er sammensatt av humane CF bronkial epitelceller og makrofager, infisert med P. aeruginosa og i stand til å representere både en diffus og immunologisk barriere. Med mål om å teste anti-infeksiøse midler ved rimelig høy gjennomstrømning, ble denne co-kulturen etablert på den gjennomtrengelige filtermembranen av brønnplateinnsatser, ved hjelp av to menneskelige cellelinjer: CFBE41o- og THP-1 monocyttavledede makrofager. Videre, for å til slutt studere avsetning av aerosoliserte anti-infeksiøs13, ble modellen etablert ved luftvæskegrensesnittet (ALI) i stedet for flytende dekket forhold (LCC).
Som vi rapporterer her, gjør denne modellen det mulig å vurdere ikke bare bakteriell overlevelse ved antibiotikabehandling, men også cellecytoktoksisitet, epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon og inflammatoriske responser, som er viktige parametere for narkotikautvikling.
Denne protokollen kombinerer to relevante celletyper for innåndingsbehandling av lungeluftveiene: makrofager og CF bronkial epitel. Disse cellene er seeded på motsatte sider av gjennomtrengelige støtteinnlegg, slik at celleeksponering for luft (kalt luft-flytende grensesnitt (ALI) forhold). Denne medkulturen av vertsceller blir senere smittet med P. aeruginosa. Begge vertscellelinjene er av menneskelig opprinnelse: epitelcellene representerer cystisk fibrose bronkial epitel, med en mutasjon på CF-kanalen (CFBE41o-), og THP-114-cellene er en godt preget makrofaglignende cellelinje. Et samløpet epitellag får først dannes på oversiden av brønnplateinnsatser før de makrofaglignende cellene legges til det motsatte rommet. Når samkulturen er etablert på ALI, er systemet inokulert med P. aeruginosa på den a apiske siden. Dette infiserte kokultursystemet brukes deretter til å vurdere effekten av et antibiotikum, for eksempel tobramycin. Følgende endepunkter analyseres: epitelbarriereintegritet når det gjelder transepithelial elektrisk motstand (TEER), visualisering av cellecelle- og cellebakterierinteraksjoner ved konfokal laserskanning av mikroskopi (CLSM), bakteriell overlevelse ved telling av kolonidannende enheter (CFU), vertscelleoverlevelse (cytotoksisitet) og cytokinfrigjøring.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

fDrug forskning for behandling av lungeinfeksjoner utvikler seg mot prediktive in vitro modeller av høy kompleksitet. Den mangefasetterte tilstedeværelsen av bakterier i lungemodeller kan tilpasse epitelordningen på nytt, mens immunceller koordinerer en inflammatorisk respons mot bakteriene i mikromiljøet. Mens in vivo modeller har vært valget for å teste nye anti-infeksiøse i sammenheng med cystisk fibrose, de fortsatt ikke nøyaktig etterligne in vivo forholdene til slike sykdommer hos mennesker og behandlingsutfall. Komplekse in vitro-modeller av de infiserte luftveiene basert på humane celler (bronkial epitel- og makrofager) og relevante patogener kan bygge bro over dette gapet og lette oversettelsen av nye antiinfeksiøs midler til klinikken. For slike formål har en co-kulturmodell av human cystisk fibrose bronkial epitelcellelinje CFBE41o- og THP-1 monocyttavledede makrofager blitt etablert, etterligne en infeksjon av human bronkial mucosa av P. aeruginosa på luftvæskegrensesnitt (ALI) forhold. Denne modellen er satt opp i syv dager, og følgende parametere vurderes samtidig: epitelbarriereintegritet, makrofagtransmigrasjon, bakteriell overlevelse og betennelse. Den nåværende protokollen beskriver et robust og reproduserbart system for evaluering av legemiddeleffekt og vertsresponser som kan være relevante for å oppdage nye anti-infeksiøsiteter og optimalisere aerosolleveringen til lungene.

Figur 1A viser morfologien til den resulterende co-kulturen av humane bronkiale epitelceller og makrofager etter å ha vokst både i 24 timer på den apiske og basolaterale siden av gjennomtrengelige støtter, henholdsvis. Epitelbarriereintegriteten er vist ved høyere TEER (834 Ω×cm2)og CLSM ved å vaksinere for det tette koblingsproteinet ZO-1 (figur 1B). De samme resultatene observert i form av barriere integritet av uinfiserte CFBE41o-</sup...

Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Vi beskriver en protokoll for en tredimensjonal co-kultur modell av infiserte luftveier, ved hjelp av CFBE41o- celler, THP-1 makrofager, og Pseudomonas aeruginosa, etablert på luft-flytende grensesnitt. Denne modellen gir en ny plattform for samtidig å teste antibiotikaeffekt, epitelbarrierefunksjon og inflammatoriske markører.

P. aeruginosa Infisert 3D-kokultur av bronkiale epitelceller og makrofager ved luftvæskegrensesnitt for preklinisk evaluering av antiinfeksiøs midler

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Så når vi evaluerer nye anti-infeksiøs, må vi ta opp to ting. Den ene siden er bakteriene. Hvis de er planktoniske eller informerte biofilmer, er den andre siden tilstedeværelsen av vertsceller, spesielt epitelvertsceller, som danner stramme biologiske barrierer.Hvis disse barrierene påvirkes, hvordan den monologiske responsen kan være, og med denne nye modellen, kan vi faktisk overvåke begge parametrene samtidig. Ved behandling av bakterielle infeksjoner må vi innse hvilket organ som påvirkes. For eksempel, hvis det er lungene, kan vi dra nytte, og lokalt administrere stoffet som en aerosol.Men hvis vi ønsker å ha en modell for å studere dette, trenger vi en modell som også tillater plasseringen av aerosoler som er tilfelle i vår modell. Den andre fordelen er at den er basert på menneskelige celler, slik at vi kan unngå problemer på grunn av forskjeller på dyr og artsforskjeller. Dette systemet kan gi deg mer innsikt i infeksjonsforskningen ved å kaste lys over molekylære og cellulære hendelser under samspillet mellom vertsceller og bakterier.Når du prøver denne protokollen for første gang, husk å sjekke cellemediet for sterilitet og cellemorfologi og å være forsiktig når du håndterer gjennomtrengelige støtter. Dyrk CFBE41 O minusceller i en T 75 kolbe med minimum essensiell medium som inneholder 10% FCS, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 600 milligram per liter glukose ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Legg til friskt medium til cellene hver to til tre dager.Etter at cellene nådde 70% samløpet, vask dem med 10 milliliter PBS og løsne med tre milliliter trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Deretter legger du til syv milliliter fersk MEM og sentrifuger cellene ved 300 ganger G i fire minutter. Etter å ha kastet det overnaturlige, på 10 milliliter mem, mens forstyrre klumpene med mild pipettering.Tell cellene med en automatisert celleteller eller hemocytometerkammer, og fortynne dem deretter til en konsentrasjon på 200 000 celler per 500 mikroliter for såing i 12 brønnplater med gjennomtrengelige støtter. Tilsett 500 mikroliter av cellefjæringen per brønn på den a apiske siden av den gjennomtrengelige støtten. Tilsett deretter 1,5 milliliter friskt medium til basal lateral side.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 72 timer. På den tredje dagen etter såing, opprett et luftvæskegrensesnitt ved å fjerne mediet fra basal lateral side først deretter fra den a apiske siden. Tilsett 500 mikroliter frisk MEM til basal lateral side og endre mediet annenhver dag til cellene danner et samløpet monolag.For å vurdere cellenes epitelbarriereegenskaper, tilsett 500 mikroliter cellemedium til den a apiske siden, og 1,5 milliliter til basal lateralsiden, og deretter returnerte platen til inkubatoren i en time. Mål transittmaterialet elektrisk motstand eller TEER med ann STX2 spisepinne elektrode og en epitelvolt ohm meter. For å dyrke THP1-celler, vokse dem i T 75 kolben ved hjelp av RPMI 1640 medium, supplert med 10% FCS ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Del cellene annenhver dag ved å så 2 millioner celler per milliliter i en ny T75 kolbe. For å skille THP1-cellene, sentrifuger innholdet i kolben ved 300 ganger G i fire minutter, kast supernatanten. Resuspend pellet i friskt medium og sette i en ny T75 kolbe.Tilsett 10 nanogram per milliliter PMA til cellene og returner dem til inkubatoren. For å løsne makrofagen som celler, vask dem en gang med PBS ved 37 grader Celsius, og inkuber dem med tre milliliter celleavløsning som inneholder 0,5 millimolar EDTA i 10 minutter ved romtemperatur. Se etter celleavløsning under et omvendt mikroskop.Når cellene har løsnet, legg til syv milliliter friskt medium og sentrifuger dem ved 300 ganger G i fire minutter. Etter å ha fjernet det overnaturante, resuspend makrofagcellene i tre milliliter av THP1 medium i et 15 milliliter konisk rør, telle cellene, og inkubere dem i maksimalt en time før du setter opp co-kulturen. For å etablere en epitelmakrofagkokultur, fjern mediet fra det nedre kammeret i CFBE41 O minus monolayers og forsiktig invertere støtten inne i et sterilt glass Petriskål, bruk en celleskraper for å fjerne cellene som er overgrodd gjennom membranporene.Plasser 200 000 THP1 makrofager i 200 mikroliter RPMI på basal lateral side av den inverterte innsatsen i hver brønn, lukk Petri-rettene og inkuber dem i to timer. Plasser deretter innsatsene tilbake i de 12 brønnmikroplatene og tilsett 500 mikroliter MEM-medium til basalsidesiden av den gjennomtrengelige innsatsen. Inokuler 15 milliliter lb supplert med 300 mikrogram per milliliter ampicillin med en enkelt koloni P aeruginosa, PAO1GFP, inkubere bakteriene i 18 timer ved 37 grader Celsius, mens risting ved 180 RPM.Etter inkubasjonen, overfør bakteriene til et 50 milliliter konisk rør, og sentrifuger ved 3850 ganger G i fem minutter. Kast overnaturvæsken og tilsett 10 milliliter steril PBS som er forvarmet til 37 grader Celsius. Mål optisk tetthet ved 600 nanometer og juster konsentrasjonen av bakterier med cellekulturmediet til en endelig konsentrasjon på 200 000 kolonidanneenheter per milliliter, noe som tilsvarer et mangfold av infeksjon av en bakterie per epitelcelle.Tilsett 100 mikroliter bakteriell suspensjon til den akiske siden av den gjennomtrengelige støtten og inkuber platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en time for å tillate bakterier å feste seg til cellene, og fjern deretter forsiktig akkal væske med en pipette for å gjenopprette ALI-forhold. For eksperimenter med medikamentell behandling, tilsett 500 mikroliter av en legemiddelløsning fortynnet i cellemedium til den a apiske siden. Tilsett deretter 1,5 milliliter cellemedium til basal lateral side.Samle 500 mikroliter av atypisk og basal lateral medium og pool dem for å vurdere CFU av ikke-tilknyttede bakterier. For å vurdere overlevelsen av vedlagte eller internaliserte bakterier, tilsett 500 mikroliter sterilt deionisert kaldt vann til hvert rom av gjennomtrengelig støtte, og inkuber cellene i 30 minutter ved romtemperatur. Hvis du vurderer CFU fra frosne prøver, tin dem ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Bruk deretter pipettespisser til å skrape membranoverflaten og ta vare på å ikke legge for mye press på brønnene. Pipette opp og ned for å fjerne alt innhold som følger. Med bakteriell suspensjon fra begge fraksjoner, lage en en til 10 seriell fortynning med PBS tween og plate bakteriene på lb agar plater.Inkuber agarplatene ved 30 grader Celsius i 16 til 72 timer, og tell deretter koloniene og beregn CFU. Morfologien til den resulterende co-kulturen av menneskelige bronkial epitelceller og makrofager på den apiske og basilikum laterale siden av de gjennomtrengelige støttene er vist her. En høyere TEER-måling og immunstaining for de tette koblingsproteinene ZO1, viste seg å være epitelbarriereintegritet.For å modellere en bakteriell infeksjon ble P aeruginosa inokulert på CFBE41 o minusceller. Makrofager ble observert på den a apiske siden av medkulturen seks timer etter infeksjon. TEER falt til 250 ohm per centimeter kvadrert, noe som indikerer en kompromittert epitelbarriere, som også ble foreslått av ZO1-farging.Makrofag trans migrasjon gjennom gjennomtrengelig filter porer og bakterier opptak av THP-1 celler på den a apical side er vist her. I THP-1 monokulturer, makrofag migrasjon så tidlig som en time etter infeksjon. I mellomtiden ble migrasjonen sett etter tre timer etter infeksjon i co-kulturen.Infiserte co-kulturer behandlet med tobramycin i seks eller 20 timer ble avbildet med konfokal skanning laser mikroskopi. Uten behandling døde enten epitelcellene eller makrofagene etter 20 timers infeksjon. Til tross for å bli sett etter seks timers behandling i mikroskopibildene, viste en CFU-analyse at bakteriene ikke spredte seg.Likevel gjenopprettet bakteriene sin spredningsevne etter 20 timers behandling. TEER av monokulturer og co kulturer ble også målt. Co-kulturen i CFBE41 o minus celler med THP-1 ikke indusere noen endringer i epitelbarriereintegriteten sammenlignet med monokulturen.Ved infeksjon falt TEER-verdien. når du utfører denne prosedyren, er det avgjørende å sikre at cellene sitter riktig og filtermembranen ikke forstyrres. Derfor må cellesåetrinnene utføres nøye.I tillegg til denne protokollen, nebulization av antibiotika på innsatsene ville gjøre det mulig å se om bakterier overlevelse endringer i forhold til nedsenkne forhold.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Fastsettelse av tolerable fettsyrer og koleratoksin Konsentrasjoner med humane Intestinal Epitelceller og BALB / c mus makrofager

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humane monocytter ved å dobbelt gradientsentrifugering og deres differensiering til Makrofager i teflonbelagt cellekultur Vesker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering av bakterieinvasjon av hjerteceller i kultur og hjertekolonisering hos infiserte mus ved hjelp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...