Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Este trabalho recebeu financiamento do Programa HORIZON 2020 da União Europeia para pesquisa, desenvolvimento tecnológico e demonstração sob o acordo de subvenção nº 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design e Desenvolvimento de Nanomedicinas avançadas para superar barreiras biológicas e tratar doenças graves. Agradecemos à Dra Ana Costa e à Dra. Agradecemos também a Chelsea Thorn por revisar nosso manuscrito.

1. Crescimento e diferenciação de células em pastilhas de suporte permeáveis
<ol><li>Cultivar CFBE41o- em um frasco T75 com 13 mL de meio essencial mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% aminoácidos não essenciais e 600 mg/L de glicose a 37 °C com atmosfera de 5 % de CO2. Adicione meio fresco às células a cada 2 a 3 dias.<ol>
<li>Retire as células após atingir 70% de confluência no frasco com 3 mL de trippsina- ácido edenediaminetetraacético (EDTA) a 37°C por ...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. 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Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Este artigo descreve um protocolo para uma cocultura 3D das vias aéreas infectadas, constituída pela linha de células epiteliais anfíquiis císticas humanas CFBE41o- e a linha de células macrófagos derivadas do monocito humano THP-1. O protocolo permite a avaliação da integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos, sobrevivência de bactérias e inflamação, que são parâmetros importantes ao testar a eficácia da droga e as respostas do hospedeiro simultaneamente. A novidade no modelo está ...

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno relevante na fibrose cística (CF) que contribui para o comprometimento do tecido pulmonar1. A produção de polissacarídeos, como alginato e outros exopolídeos mucoides, coordena o progresso da doença, que leva à tenaz adesão bacteriana, limita a entrega de antibióticos a bactérias e protege as bactérias contra o sistema imunológico hospedeiro2. A transição da P. aeruginosa da fase planctônica para a formação de biofilmes é uma questão crítica nesse contexto, facilitando também a ocorrência de tolerância a antibióticos.
No contexto da CF, o mouse tem sido usado principalmente como modelo. Os camundongos, no entanto, não desenvolvem espontaneamente essa doença com a introdução de mutações CF3. A maioria dos estudos de desenvolvimento de biofilme bacteriano e suscetibilidade a medicamentos tem sido realizada em superfícies abióticas, como placas de Petri. No entanto, essa abordagem não representa a complexidade in vivo. Por exemplo, importantes barreiras biológicas estão ausentes, incluindo células imunes, bem como o epitélio mucosa. Embora p. aeruginosa seja bastante tóxica para células epiteliais, alguns grupos conseguiram co-cultivar um biofilme P. aeruginosa anterior com células brônquicas humanas. Essas células originaram-se de pacientes com fibrose cística com mutação CFTR (CFBE41o- células)4 e permitiram avaliar a eficácia do antibiótico5 ou avaliar a correção da proteína CFTR durante a infecção6. Tal modelo mostrou-se para melhorar a previsibilidade da eficácia da droga, além de possibilitar a caracterização de problemas com drogas que falharam em fases posteriores do desenvolvimento de medicamentos7.
No entanto, no pulmão, o epitélio mucosa é exposto ao ar. Além disso, as células imunes presentes nas vias aéreas, como macrófagos teciduais, desempenham um papel essencial contra patógenos ou partículas inaladas8. Macrófagos migram através das diferentes camadas celulares para alcançar o lúmen brônquico e combater a infecção. Além disso, as drogas inaladas também têm que lidar com a presença de muco como um elemento não celular adicional da barreira ar-sangue pulmonar9. De fato, vários modelos in vitro tridimensionais complexos (3D) foram desenvolvidos, com o objetivo de aumentar a relevância in vivo. Sistemas de co-cultura não só aumentam a complexidade de sistemas in vitro para descoberta de drogas, mas também permitem estudar interações célula-células. Tal complexidade tem sido abordada em estudos sobre a migração de macrófagos10, a liberação de peptídeos antimicrobianos por neutrófilos11, o papel do muco na infecção9, e a reação das células epiteliais ao dano excessivo12. No entanto, um modelo in vitro infectado por CF confiável que apresenta a mutação genética em CF, que é exposto ao ar (aumento da condição fisiológica), e integra as células imunes ainda está em falta.
Para preencher essa lacuna, descrevemos um protocolo para a co-cultura 3D humana estável das vias aéreas infectadas. O modelo é constituído por células epiteliais e macrófagos bronquiais humanos, infectados com P. aeruginosa e capazes de representar uma barreira difuso e imunológica. Com o objetivo de testar anti-infecciosos a uma taxa razoavelmente alta, esta co-cultura foi estabelecida na membrana de filtro permeável de pastilhas de placas de poço, utilizando duas linhas de células humanas: CFBE41o- e macrófagos derivados de monócitos THP-1. Além disso, para eventualmente estudar a deposição de anti-infecciosos aerossolizados13,o modelo foi estabelecido na interface ar-líquido (ALI) em vez de condições cobertas líquidas (LCC).
Como relatamos aqui, este modelo permite avaliar não apenas a sobrevivência bacteriana em um tratamento antibiótico, mas também citotoxicidade celular, integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos e respostas inflamatórias, que são parâmetros essenciais para o desenvolvimento de medicamentos.
Este protocolo combina dois tipos de células relevantes para a terapia de inalação das vias aéreas pulmonares: macrófagos e epitélio bronquial cf. Essas células são semeadas em lados opostos de pastilhas de suporte permeáveis, permitindo a exposição celular ao ar (chamada de interface ar-líquido (ALI). Esta co-cultura de células hospedeiras é subsequentemente infectada com P. aeruginosa. Ambas as linhas celulares hospedeiras são de origem humana: as células epiteliais representam o epitélio brônquico da fibrose cística, com uma mutação no canal CF (CFBE41o-), e as células THP-114 são uma linha celular bem caracterizada como macrófago. Uma camada epitelial confluente é permitida pela primeira vez para se formar no lado superior das pastilhas de placas de poço antes que as células semelhantes ao macrófago sejam adicionadas ao compartimento oposto. Uma vez que a co-cultura é estabelecida na ALI, o sistema é inoculado com P. aeruginosa no lado apical. Este sistema de cocultura infectado é então usado para avaliar a eficácia de um antibiótico, por exemplo, tobramicina. São analisados os seguintes pontos finais: integridade da barreira epitelial em termos de resistência elétrica transepitelial (TEER), visualização de interações célula-célula-célula-célula-bactérias por microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), sobrevivência bacteriana por contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), sobrevivência celular hospedeira (citotoxicidade) e liberação de citocinas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

A pesquisa de fDrug para o tratamento de infecções pulmonares está progredindo para modelos in vitro preditivos de alta complexidade. A presença multifacetada de bactérias em modelos pulmonares pode retransformar o arranjo epitelial, enquanto as células imunes coordenam uma resposta inflamatória contra as bactérias no microambiente. Embora os modelos in vivo tenham sido a escolha para testar novos anti-infecciosos no contexto da fibrose cística, eles ainda não imitam com precisão as condições in vivo de tais doenças em humanos e os desfechos do tratamento. Modelos in vitro complexos das vias aéreas infectadas com base em células humanas (epiteliais brônquicais e macrófagos) e patógenos relevantes poderiam preencher essa lacuna e facilitar a tradução de novos anti-infecciosos para a clínica. Para tais efeitos, foi estabelecido um modelo de co-cultura da linha de células epiteliais antelásticas císticas humanas CFBE41o- e macrófagos derivados do monócito THP-1, imitando uma infecção da mucosa brônquica humana por P. aeruginosa em condições de interface ar-líquido (ALI). Este modelo é configurado em sete dias, e os seguintes parâmetros são avaliados simultaneamente: integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófago, sobrevida bacteriana e inflamação. O presente protocolo descreve um sistema robusto e reprodutível para avaliar a eficácia da droga e respostas do hospedeiro que poderiam ser relevantes para a descoberta de novos anti-infecciosos e a otimização de sua entrega de aerossol para os pulmões.

A Figura 1A mostra a morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais e macrófagos brônquicos humanos depois de crescer tanto por 24 h no lado apical e basolateral de suportes permeáveis, respectivamente. A integridade da barreira epitelial é mostrada por TEER (834 Ω×cm2) e CLSM por imunostaining para a proteína de junção apertada ZO-1 (Figura 1B). Os mesmos resultados observados em termos de integridade de barreira de CFBE41o não...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Então, quando estamos avaliando novos anti-infecciosos, temos que abordar duas coisas. Um lado é a bactéria. Se são biofilmes planctônicos ou informados, o outro lado é a presença de células hospedeiras, especialmente células hospedeiras epiteliais, que formam barreiras biológicas apertadas.Se essas barreiras forem efetuadas, como a resposta monológica pode ser, e com este novo modelo, podemos realmente monitorar ambos os parâmetros ao mesmo tempo. Ao tratar infecções bacterianas, temos que perceber que órgão é afetado. Por exemplo, se for o pulmão, podemos tirar vantagem, e administrar a droga como aerossol.No entanto, se queremos ter um modelo para estudar isso, precisamos de um modelo que também permita a posição dos aerossóis que é o caso em nosso modelo. A outra vantagem é que é baseado em células humanas, para que possamos evitar problemas devido às diferenças com animais e espécies. Este sistema poderia dar-lhe mais informações sobre o campo da pesquisa de infecções, lançando luz sobre eventos moleculares e celulares durante a interação de células hospedeiras e bactérias.Ao tentar este protocolo pela primeira vez, lembre-se de verificar o meio celular para esterilidade e morfologia celular e ter cuidado ao manusear os suportes permeáveis. Cultivar CFBE41 O menos células em um frasco T 75 com meio essencial mínimo contendo 10% FCS, aminoácidos não essenciais de 1% e 600 miligramas por litro de glicose a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Adicione meio fresco às células a cada dois ou três dias.Depois que as células atingirem 70% de confluência, lave-as com 10 mililitros de PBS e desista com três mililitros de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione sete mililitros de MEM fresco e centrifugar as células a 300 vezes G por quatro minutos. Depois de descartar o supernascimento, a 10 mililitros de MEM, enquanto interrompa as moitas com tubulação suave.Conte as células com um contador celular automatizado ou câmara hemocitâmmetro, em seguida, dilui-as a uma concentração de 200.000 células por 500 microliters para semeadura em 12 placas de poço com suportes permeáveis. Adicione 500 microliters da suspensão celular por poço ao lado apical do suporte permeável. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio fresco ao lado lateral basal.Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. No terceiro dia após a semeadura, crie uma interface líquida de ar removendo o meio do lado lateral basal primeiro e depois do lado apical. Adicione 500 microliters de MEM fresco ao lado lateral basal e mude o meio a cada dois dias até que as células formem uma monocamada confluente.Para avaliar as propriedades da barreira epitelial das células, adicione 500 microliters de meio celular ao lado apical e 1,5 mililitros ao lado lateral basal, em seguida, devolveu a placa à incubadora por uma hora. Meça a resistência elétrica do material de trânsito ou TEER com eletrodo de pauzinho ann STX2 e um medidor de volts epiteliais. Para cultivar células THP1, plante-as no frasco T 75 usando o meio RPMI 1640, suplementado com 10% FCS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Divida as células a cada dois dias semeando 2 milhões de células por mililitro em um novo frasco T75. Para diferenciar as células THP1, centrifugar o conteúdo do frasco a 300 vezes G por quatro minutos, descartar o supernasce. Resuspenque a pelota em meio fresco e coloque um novo frasco T75.Adicione 10 nanogramas por mililitro PMA às células e devolva-os à incubadora. Para desprender o macrófago como células, lave-as uma vez com PBS a 37 graus Celsius, e incuba-as com três mililitros de solução de descolamento celular contendo 0,5 mililitro EDTA por 10 minutos à temperatura ambiente. Verifique se há desprendimento celular sob um microscópio invertido.Quando as células se separarem, adicione sete mililitros de meio fresco e centrífugue-os a 300 vezes G durante quatro minutos. Depois de remover o supernaspeuta, resuspengue as células macrófagos em três mililitros de meio THP1 em um tubo cônico de 15 mililitros, conte as células e incuba-as por um máximo de uma hora antes de configurar a co-cultura. Para estabelecer uma co-cultura de macrófago epitelial, remova o meio da câmara inferior do CFBE41 O menos monocamadas e inverta cuidadosamente o suporte dentro de uma placa de petri de vidro estéril, use um raspador de células para remover as células sobrelculcidas através dos poros de membrana.Coloque 200.000 macrófagos THP1 em 200 microliters de RPMI no lado lateral basal da inserção invertida em cada poço, feche as placas de Petri e incuba-as por duas horas. Em seguida, coloque as pastilhas de volta nas 12 micro placas de poço e adicione 500 microliters de meio MEM ao lado lateral basal da inserção permeável. Inoculado 15 mililitros de lb suplementados com 300 microgramas por mililitro ampicillin com uma única colônia de P aeruginosa, PAO1GFP, incubam a bactéria por 18 horas a 37 graus Celsius, enquanto tremem a 180 RPM.Após a incubação, transfira a bactéria para um tubo cônico de 50 mililitros, e centrífugas a 3.850 vezes G durante cinco minutos. Descarte o supernascer e adicione 10 mililitros de PBS estéreis que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Medir a densidade óptica em 600 nanômetros e ajustar a concentração de bactérias com o meio de cultura celular para uma concentração final de 200.000 unidades formadoras de colônias por mililitro, o que corresponde a uma multiplicidade de infecção de uma bactéria por célula epitelial.Adicione 100 microliters de suspensão bacteriana ao lado apical do suporte permeável e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora para permitir que as bactérias se conectem às células, depois remova cuidadosamente o líquido apical com uma pipeta para restaurar as condições de ALI. Para experimentos com tratamento medicamentoso, adicione 500 microliters de uma solução medicamentosa diluída em meio celular ao lado apical. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio celular ao lado lateral basal.Colete 500 microlitadores do meio lateral atípico e basal e junte-os para avaliar a UFC de bactérias não ligadas. Para avaliar a sobrevivência de bactérias anexadas ou internalizadas, adicione 500 microliters de água fria deionizada estéril a cada compartimento do suporte permeável e incuba as células por 30 minutos à temperatura ambiente. Se avaliar a UFC a partir de amostras congeladas, descongele-as a 37 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, use pontas de pipeta para raspar a superfície da membrana tomando cuidado para não colocar muita pressão sobre os poços. Pipeta para cima e para baixo para remover todo o conteúdo aderido. Com a suspensão bacteriana de ambas as frações, faça uma diluição serial de um a 10 com interpolação PBS e emplaque as bactérias em placas de ágar lb.Incubar as placas de ágar a 30 graus Celsius por 16 a 72 horas, depois conte as colônias e calcule a UFC. A morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais brônquicas humanas e macrófagos no lado lateral apical e manjericão dos suportes permeáveis são mostrados aqui. Uma maior medição de TEER e imunostaining para as proteínas de junção apertada ZO1, provaram a integridade da barreira epitelial.Para modelar uma infecção bacteriana, p aeruginosa foi inoculada em células CFBE41 o menos. Macrófagos foram observados no lado apical da co-cultura seis horas após a infecção. O TEER caiu para 250 ohm por centímetro quadrado, indicando uma barreira epitelial comprometida, que também foi sugerida pela coloração ZO1.A migração trans do macrófago através dos poros de filtro permeáveis e da absorção de bactérias por células THP-1 no lado apical é mostrada aqui. Nas monoculturas THP-1, migração de macrófagos já em uma hora após a infecção. Enquanto isso, a migração foi vista após três horas após a infecção na co-cultura.Co-culturas infectadas tratadas com tobramicina por seis ou 20 horas foram imagens com microscopia a laser de varredura confocal. Sem tratamento, as células epiteliais ou os macrófagos morreram após 20 horas de infecção. Apesar de ter sido visto após seis horas de tratamento nas imagens de microscopia, um ensaio da UFC demonstrou que a bactéria não se proliferava.No entanto, as bactérias recuperaram sua capacidade de proliferação após o tratamento de 20 horas. O TEER de monoculturas e co culturas também foram medidos. A co-cultura de CÉLULAS CFBE41 o menos com THP-1 não induziu nenhuma alteração na integridade da barreira epitelial em comparação com a monocultura.Após a infecção, o valor do TEER caiu. Ao realizar este procedimento, é crucial garantir que as células estejam sentadas corretamente e que a membrana do filtro não seja interrompida. Portanto, as etapas de semeadura celular precisam ser realizadas com cuidado.Além desse protocolo, a nebulização de antibióticos nas pastilhas permitiria ver se a sobrevivência das bactérias muda em comparação com as condições submersas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Determinação de ácidos graxos tolerável e Concentrações toxina da cólera Usando Humanos células epiteliais intestinais e BALB / c mouse macrófagos

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...