Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Este trabajo recibió financiación del Programa HORIZON 2020 de la Unión Europea para la investigación, el desarrollo tecnológico y la demostración en virtud del acuerdo de subvención No 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Diseño y Desarrollo de Nanomedicinas avanzadas para superar las barreras biológicas y tratar enfermedades graves. Agradecemos a la Dra. Ana Costa y a la Dra. Jenny Juntke el gran apoyo en el desarrollo de la cocultura, Olga Hartwig, por la ilustración científica, Anja Honecker, por los ensayos ELISA, Petra Konig, Jana Westhues y la Dra. Chiara De Rossi por el apoyo en el cultivo celular, la analítica y la microscopía. También agradecemos a Chelsea Thorn por revisar nuestro manuscrito.

1. Crecimiento y diferenciación de células en plaquitas de soporte permeable
<ol><li>Cultivar CFBE41o- en un matraz T75 con 13 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales y 600 mg/L de glucosa a 37oC con una atmósfera de 5 % de CO2. Agregue un medio fresco a las células cada 2-3 días.<ol>
<li>Separar las células después de alcanzar el 70% de confluencia en el matraz con 3 ml de ácido etilenocrifaminatetraacético (ED...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Este artículo describe un protocolo para un cocultivo 3D de las vías respiratorias infectadas, constituido por la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o- y la línea celular de macrófagos derivados de monocitos humanos THP-1. El protocolo permite evaluar la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos, la supervivencia de las bacterias y la inflamación, que son parámetros importantes al probar simultáneamente la eficacia de los fármacos y las respuestas del...

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno relevante en la fibrosis quística (CF) que contribuye al deterioro del tejido pulmonar1. La producción de polisacáridos, como el alginato y otros exopolísacáridos mucoides, coordina el progreso de la enfermedad, que conduce a la adherencia bacteriana tenaz, limita la entrega de antibióticos a las bacterias y protege las bacterias contra el sistema inmunitario huésped2. La transición de P. aeruginosa de la etapa planctónica a la formación de biopelículas es un tema crítico en este contexto, facilitando también la aparición de tolerancia a antibióticos.
En el contexto de CF, el ratón se ha utilizado principalmente como modelo. Los ratones, sin embargo, no desarrollan espontáneamente esta enfermedad con la introducción de mutaciones DE CF3. La mayoría de los estudios de biopelícula bacteriana y susceptibilidad a fármacos se han realizado en superficies abióticas, como los platos Petri. Sin embargo, este enfoque no representa la complejidad in vivo. Por ejemplo, hay barreras biológicas importantes, incluidas las células inmunitarias, así como el epitelio mucoso. Aunque P. aeruginosa es bastante tóxico para las células epiteliales, algunos grupos han logrado co-cultivar un biofilm anterior de P. aeruginosa con células bronquiales humanas. Estas células se originaron en pacientes con fibrosis quística con mutación CFTR (CFBE41o- células)4 y permitieron evaluar la eficacia de los antibióticos5 o evaluar la corrección de la proteína CFTR durante la infección6. Se demostró que este modelo mejora la previsibilidad de la eficacia de los fármacos, además de permitir la caracterización de problemas con fármacos que fracasaron en fases posteriores del desarrollo de fármacos7.
Sin embargo, en el pulmón, el epitelio muesca está expuesto al aire. Además, las células inmunitarias presentes en las vías respiratorias, como los macrófagos tisulares, desempeñan un papel esencial contra los patógenos o partículas inhalados8. Los macrófagos migran a través de las diferentes capas celulares para alcanzar el lumen bronquial y combatir la infección. Además, los medicamentos inhalados también tienen que hacer frente a la presencia de moco como un elemento no celular adicional de la barrera pulmonar aire-sangre9. De hecho, se han desarrollado varios modelos tridimensionales complejos (3D) in vitro, con el objetivo de aumentar la relevancia in vivo. Los sistemas de co-cultivo no sólo aumentan la complejidad de los sistemas in vitro para el descubrimiento de fármacos, sino que también permiten estudiar las interacciones células celulares. Tal complejidad se ha abordado en estudios sobre la migración de macrófagos10, la liberación de péptidos antimicrobianos por neutrófilos11, el papel de la mucosidad en la infección9, y la reacción de células epiteliales al daño excesivo12. Sin embargo, todavía falta un modelo in vitro infectado por CF fiable que presenta la mutación genética en CF, que está expuesta al aire (aumento de la condición fisiológica), e integra las células inmunitarias.
Para cerrar esta brecha, describimos un protocolo para el co-cultivo humano estable en 3D de las vías respiratorias infectadas. El modelo está constituido por células epiteliales bronquiales y macrófagos humanos, infectados con P. aeruginosa y capaces de representar una barrera difusa e inmunológica. Con el objetivo de probar los antiinfecciosos a un rendimiento razonablemente alto, este co-cultivo se estableció en la membrana de filtro permeable de las plaquitas de pozos, utilizando dos líneas celulares humanas: CFBE41o- y THP-1 monophages derivados de monocitos. Además, para estudiar finalmente la deposición de los antiinfecciosos aerosolizados13, el modelo se estableció en la interfaz aire-líquido (ALI) en lugar de en condiciones de cobertura líquida (LCC).
Como informamos aquí, este modelo permite evaluar no sólo la supervivencia bacteriana sobre un tratamiento antibiótico, sino también la citotoxicidad celular, la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos y las respuestas inflamatorias, que son parámetros esenciales para el desarrollo de fármacos.
Este protocolo combina dos tipos celulares relevantes para la terapia de inhalación de las vías respiratorias pulmonares: macrófagos y epitelio bronquial CF. Estas células se siembran en lados opuestos de inserciones de soporte permeables, lo que permite la exposición celular al aire (llamadas condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este co-cultivo de células huésped se infecta posteriormente con P. aeruginosa. Ambas líneas celulares del huésped son de origen humano: las células epiteliales representan el epitelio bronquial de fibrosis quística, con una mutación en el canal CF (CFBE41o-), y las células THP-114 son una línea celular bien caracterizada similar a un macrófago. Primero se permite que una capa epitelial confluente se forme en la parte superior de las inserciones de placas de pozo antes de que las células similares a los macrófagos se añadan al compartimiento opuesto. Una vez establecida la cocultura en ALI, el sistema se inocula con P. aeruginosa en el lado apical. Este sistema de co-cultivo infectado se utiliza entonces para evaluar la eficacia de un antibiótico, por ejemplo, tobramicina. Se analizan los siguientes puntos finales: integridad de la barrera epitelial en términos de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), visualización de interacciones células celulares y células-bacterias mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), supervivencia bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (CFU), supervivencia de células huésped (citotoxicidad) y liberación de citoquinas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

La investigación fDrug para el tratamiento de infecciones pulmonares está progresando hacia modelos predictivos in vitro de alta complejidad. La presencia multifacética de bacterias en los modelos pulmonares puede volver a adaptar la disposición epitelial, mientras que las células inmunitarias coordinan una respuesta inflamatoria contra las bacterias en el microambiente. Si bien los modelos in vivo han sido la opción de probar nuevos antiinfecciosos en el contexto de la fibrosis quística, todavía no imitan con precisión las condiciones in vivo de tales enfermedades en los seres humanos y los resultados del tratamiento. Los modelos complejos in vitro de las vías respiratorias infectadas a base de células humanas (epiteliales bronquiales y macrófagos) y patógenos relevantes podrían cerrar esta brecha y facilitar la traducción de nuevos antiinfecciosos a la clínica. Para ello, se ha establecido un modelo de cultivo de co-cultivo de la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o- y de los macrófagos derivados de monocitos THP-1, imitando una infección de la mucosa bronquial humana por P. aeruginosa en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este modelo se configura en siete días, y los siguientes parámetros se evalúan simultáneamente: integridad de la barrera epitelial, transmigración de macrófagos, supervivencia bacteriana e inflamación. El presente protocolo describe un sistema robusto y reproducible para evaluar la eficacia de los fármacos y las respuestas del huésped que podrían ser relevantes para descubrir nuevos antiinfecciosos y optimizar su entrega de aerosoles a los pulmones.

La Figura 1A muestra la morfología del coculo resultante de células epiteliales bronquiales humanas y macrófagos después de crecer durante 24 h en el lado apical y basolateral de los soportes permeables, respectivamente. La integridad de la barrera epitelial se muestra con UNER más alto (834 x cm 2 ) y CLSMmediantela inmunostaining para la proteína de unión estrecha ZO-1(Figura 1B). Los mismos resultados observados en términos de integridad de...

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P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Así que cuando estamos evaluando nuevos anti-infecciosos, tenemos que abordar dos cosas. Un lado son las bacterias. Si son biopelículas planctónicas o informadas, el otro lado es la presencia de células huésped, especialmente células huésped epiteliales, que forman barreras biológicas estrechas.Si se realizan estas barreras, cómo podría ser la respuesta monológica, y con este nuevo modelo, podemos monitorear ambos parámetros al mismo tiempo. Al tratar las infecciones bacterianas, tenemos que darnos cuenta de qué órgano está afectado. Por ejemplo, si es el pulmón, podemos tomar ventaja, y administrar tópicamente el medicamento como un aerosol.Sin embargo, si queremos tener un modelo para estudiar esto, necesitamos un modelo que también permita la posición de aerosoles que es el caso en nuestro modelo. La otra ventaja es que se basa en células humanas, para que podamos evitar problemas debido a diferencias en animales y especies diferencias. Este sistema podría darle más información sobre el campo de la investigación de infecciones mediante el derramamiento de luz sobre eventos moleculares y celulares durante la interacción de las células anfitrionas y bacterias.Al intentar este protocolo por primera vez, recuerde comprobar el medio celular en busca de esterilidad y morfología celular y tener cuidado al manejar los soportes permeables. Cultivar células CFBE41 O menos en un matraz T 75 con medio esencial mínimo que contenga 10%FCS, 1%aminoácidos no esenciales y 600 miligramos por litro de glucosa a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Agregue un medio fresco a las células cada dos o tres días.Después de que las células alcanzaron el 70% de confluencia, lávelas con 10 mililitros de PBS y desprendidas con tres mililitros de trippsina EDTA a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, agregue siete mililitros de MEM fresco y centrifugar las células a 300 veces G durante cuatro minutos. Después de desechar el sobrenadante, a 10 mililitros de MEM, mientras se interrumpen los grumos con pipeteo suave.Contar las células con un contador de células automatizado o una cámara de hemocitociómetro, luego diluirlas a una concentración de 200.000 células por cada 500 microlitros para la siembra en 12 placas de pozos con soportes permeables. Añadir 500 microlitros de la suspensión celular por pozo al lado apical del soporte permeable. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio fresco al lado lateral basal.Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 72 horas. Al tercer día después de la siembra, cree una interfaz de líquido de aire quitando el medio del lado lateral basal primero y luego del lado apical. Añadir 500 microlitros de MEM fresco al lado lateral basal y cambiar el medio cada segundo día hasta que las células formen una monocapa confluente.Para evaluar las propiedades de barrera epitelial de las células, agregue 500 microlitros de medio celular al lado apical, y 1,5 mililitros al lado lateral basal, luego devolvió la placa a la incubadora durante una hora. Mida la resistencia eléctrica del material de tránsito o TEER con un electrodo de palillo STX2 ann y un medidor epitelial de voltios ohm. Para cultivar células THP1, cultivarlas en el matraz T 75 usando el medio RPMI 1640, complementado con 10%FCS a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.Divida las células cada segundo día sembrando 2 millones de células por mililitro en un nuevo matraz T75. Para diferenciar las células THP1, centrifugar el contenido del matraz a 300 veces G durante cuatro minutos, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en medio fresco y poner en un nuevo matraz T75.Añadir 10 nanogramos por mililitro PMA a las células y devolverlos a la incubadora. Para separar los macrófagos como células, lávelos una vez con PBS a 37 grados celsius, e incubarlos con tres mililitros de solución de desprendimiento celular que contiene 0,5 EDTA milimolares durante 10 minutos a temperatura ambiente. Compruebe si hay desprendimiento celular bajo un microscopio invertido.Cuando las células se hayan desprendido, agregue siete mililitros de medio fresco y centrifugarlas a 300 veces G durante cuatro minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspender las células del macrófago en tres mililitros de THP1 medio en un tubo cónico de 15 mililitros, contar las células e incubarlas durante un máximo de una hora antes de configurar el co-cultivo. Para establecer un cocultivo de macrófagos epiteliales, retire el medio de la cámara inferior de los monocapas CFBE41 O menos e invierta cuidadosamente el soporte dentro de un plato petri de vidrio estéril, utilice un rascador celular para eliminar las células que crecen a través de los poros de membrana.Coloque 200.000 macrófagos THP1 en 200 microlitros de RPMI en el lado lateral basal de la plaquita invertida en cada pozo, cierre los platos de Petri e incubarlos durante dos horas. A continuación, vuelva a colocar las plaquitas en las micro placas de 12 pozos y añada 500 microlitros de medio MEM al lado lateral basal de la plaquita permeable. Inocular 15 mililitros de lb suplementados con 300 microgramos por mililitro ampolla con una sola colonia de P aeruginosa, PAO1GFP, incubar las bacterias durante 18 horas a 37 grados Celsius, mientras que agita a 180 RPM.Después de la incubación, transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 mililitros, y centrífugas a 3.850 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de PBS estéril que se haya precalentado a 37 grados centígrados. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros y ajuste la concentración de bacterias con el medio de cultivo celular a una concentración final de 200.000 unidades formadoras de colonias por mililitro, que corresponde a una multiplicidad de infección de una bacteria por célula epitelial.Añadir 100 microlitros de suspensión bacteriana al lado apical del soporte permeable e incubar la placa a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono durante una hora para permitir que las bacterias se adhieran a las células, luego retire cuidadosamente el líquido apical con una pipeta para restaurar las condiciones de ALI. Para experimentos con el tratamiento farmacológico, agregue 500 microlitros de una solución de fármaco diluida en medio celular al lado apical. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio celular al lado lateral basal.Recoger 500 microlitros del medio lateral atípico y basal y agruparlos para evaluar la CFU de bacterias no unidas. Para evaluar la supervivencia de las bacterias unidas o internalizadas, agregue 500 microlitros de agua fría desionizada estéril a cada compartimiento del soporte permeable, e incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si evalúa la CFU a partir de muestras congeladas, descongele a 37 grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, utilice puntas de pipeta para raspar la superficie de la membrana teniendo cuidado de no poner demasiada presión sobre los pozos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todo el contenido adherido. Con la suspensión bacteriana de ambas fracciones, haga una dilución en serie de uno a 10 con interpolación PBS y plato las bacterias en placas de agar lb.Incubar las placas de agar a 30 grados celsius durante 16 a 72 horas, luego contar las colonias y calcular la CFU. La morfología del coculo resultante de las células epiteliales bronquiales humanas y los macrófagos en el lado apical y lateral de los soportes permeables se muestran aquí. Una medición e inmunosuchación DE TEER más alta para las proteínas de unión ajustada ZO1, demostró integridad de barrera epitelial.Para modelar una infección bacteriana, P aeruginosa se inoculó en células CFBE41 o menos. Se observaron macrófagos en el lado apical del cocultivo seis horas después de la infección. El TEER bajó a 250 ohmios por centímetro cuadrado, lo que indica una barrera epitelial comprometida, que también fue sugerida por la tinción ZO1.Aquí se muestra la migración trans de macrófagos a través de los poros de filtro permeables y la absorción de bacterias por las células THP-1 en el lado apical. En los monocultivos THP-1, la migración de macrófagos ya una hora después de la infección. Mientras tanto, la migración se vio después de tres horas después de la infección en el co-cultivo.Los co-cultivos infectados tratados con tobramicina durante seis o 20 horas fueron explorados con microscopía láser de escaneo confocal. Sin tratamiento, las células epiteliales o los macrófagos murieron después de 20 horas de infección. A pesar de ser visto después de seis horas de tratamiento en las imágenes de microscopía, un ensayo de UFC demostró que la bacteria no proliferaba.Sin embargo, las bacterias recuperaron su capacidad de proliferación después del tratamiento de 20 horas. También se midieron los TEER de monocultivos y cocultivos. El cocultivo de las células CFBE41 o menos con THP-1 no indujo ningún cambio en la integridad de la barrera epitelial en comparación con el monocultivo.Tras la infección, el valor TEER bajó. al realizar este procedimiento, es crucial asegurarse de que las células están asentadas correctamente y la membrana del filtro no se interrumpe. Por lo tanto, los pasos de siembra de celdas deben realizarse cuidadosamente.Además de este protocolo, la nebulización de antibióticos en las inserciones permitiría ver si la supervivencia de las bacterias cambia en comparación con las condiciones sumergidas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...