Name: p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives
Uploaded: 2020-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

Detta arbete fick finansiering från EU:s HORIZON 2020-program för forskning, teknisk utveckling och demonstration enligt bidragsavtal nr 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Design, and Development of advanced Nanomedicines to overcome Biological Barriers and to treat severe diseases. Vi tackar Dr Ana Costa och Dr Jenny Juntke för det stora stödet för utvecklingen av samkulturen, Olga Hartwig, för den vetenskapliga illustrationen, Anja Honecker, för ELISA analyser, Petra König, Jana Westhues och Dr Chiara De Rossi för stöd på cellkultur, analys och mikroskopi. Vi tackar också Chelsea Thorn för korrekturläsning av vårt manuskript.

1. Tillväxt och differentiering av celler i genomsläppliga stödinsatser
<ol><li>Odla CFBE41o- i en T75-kolv med 13 mL av minimum essentiellt medium (MEM) som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% icke-essentiella aminosyror och 600 mg/L glukos vid 37 °C med 5 % CO2-atmosfär. Lägg till färskt medium till cellerna var 2–3 dag.<ol>
<li>Lossa cellerna efter att ha nått 70% sammanflödet i kolven med 3 mL trypsin- Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37°C i 15 min. Tillsätt 7 mL fär...

<ol>
	<li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection:+Lessons+from+a+versatile+opportunist.">Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist.</a> Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).</li><li>Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+cystic+fibrosis:+Phenotypic+analysis+and+research+applications.">Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+tobramycin+and+aztreonam+versus+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+human+airway+epithelial+cells.">In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).</li><li>Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+models+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+grown+on+live+human+airway+cells.">Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).</li><li>Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+reduces+VX-809+stimulated+F508del-CFTR+chloride+secretion+by+airway+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).</li><li>Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+and+host+immunity+to+infection.">Lung dendritic cells and host immunity to infection.</a> European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).</li><li>Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+pulmonary+barrier:+New+insights+to+improve+the+efficiency+of+inhaled+therapeutics.">Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics.</a> European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).</li><li>Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+and+phagocytosis+of+macrophages+in+an+airway+infection+model+using+four-dimensional+techniques.">Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).</li><li>Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+proteostasis+to+repair+the+F508del-CFTR+defect+in+cystic+fibrosis.">Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis.</a> Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).</li><li>Kletting, S., Barthold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+alveolar+epithelial+(hAELVi)+and+macrophage+(THP-1)+cell+lines.">Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines.</a> Altex. 35 (2), 211-222 (2018).</li><li>Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+state+of+differentiation+of+THP-1+cells+induced+by+phorbol+ester+and+1,25-dihydroxyvitamin+D3.">Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3.</a> Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).</li><li>Castoldi, A., Empting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspherical+and+Spherical+InvA497-Functionalized+Nanocarriers+for+Intracellular+Delivery+of+Anti-Infective+Agents.">Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents.</a> Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).</li><li>Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzm&#225;n, C. A., Schulze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+Vaccine+Adjuvant+System+Alum/c-di-AMP+Results+in+Quantitative+and+Qualitative+Enhanced+Immune+Responses+Post+Immunization.">The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).</li><li>Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+selective+autophagy-induction+rescues+&#948;F508-CFTR+and+inhibits+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+cystic+fibrosis.">Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues &#948;F508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis.</a> PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).</li><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).</li><li>Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).</li><li>Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes.">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS ONE. 5 (1), (2010).</li><li>Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+tract+infection+with+a+sugar+solution+-+A+case+report+on+a+lectin+based+therapeutic+principle.">Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle.</a> Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).</li><li>Klinger-Strobel, M., Lautenschl&#228;ger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+pulmonary+drug+delivery+strategies+for+infections+in+cystic+fibrosis+-+where+do+we+stand.">Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+in+vitro+model+of+cystic+fibrosis+small+airway+epithelium:+characterisation+of+the+human+bronchial+epithelial+cell+line+CFBE41o-.">Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-.</a> Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).</li><li>Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cultured+airway+cells+by+a+fosfomycin/tobramycin+antibiotic+combination.">Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination.</a> Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).</li><li>Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+antimicrobial+interventions.">Nanomedicines for antimicrobial interventions.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).</li><li>Savla, R., Minko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+approaches+for+inhalation+treatment+of+fibrosis.">Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).</li><li>Ho, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+strategies+in+drug+delivery+systems+for+treatment+of+pulmonary+infections.">Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).</li></ol>

Detta dokument beskriver ett protokoll för en 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna, som utgörs av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o- och den mänskliga monocyte-härledda makrofag cellinje THP-1. Protokollet tillåter bedömning av epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakterier överlevnad, och inflammation, som är viktiga parametrar när man testar läkemedelseffekt och host-svar samtidigt. Nyheten i modellen ligger inom införlivandet av epitelceller (dvs. hu...

Pseudomonas aeruginosa är en relevant patogen vid cystisk fibros (CF) som bidrar till nedsatt lungvävnad1. Produktionen av polysackarider, såsom alginat och andra mucoid exopolysackarider, samordnar sjukdomsförloppet, vilket leder till envis bakteriell följsamhet, begränsar leveransen av antibiotika till bakterier och skyddar bakterierna mot värd immunsystemet2. Övergången av P. aeruginosa från planktonstadiet till biofilmbildning är en kritisk fråga i detta sammanhang, vilket också underlättar förekomsten av antibiotikatolerans.
I samband med CF har musen främst använts som modell. Möss, dock inte spontant utveckla denna sjukdom med införandet av CF mutationer3. De flesta av de bakteriella biofilm utveckling och läkemedel känslighet studier har utförts på abiotiska ytor, såsom Petriskålar. Detta tillvägagångssätt representerar dock inte in vivo-komplexiteten. Till exempel är viktiga biologiska hinder frånvarande, inklusive immunceller samt slemhinnan epitel. Även P. aeruginosa är ganska giftigt för epitelceller, vissa grupper har lyckats samodla en tidigare P. aeruginosa biofilm med mänskliga bronkial celler. Dessa celler härstammar från patienter med cystisk fibros med CFTR-mutation (CFBE41o- celler)4 och som tillåts bedömaantibiotikaeffekt 5 eller bedöma korrigeringen av CFTR-proteinet under infektion6. En sådan modell visade sig förbättra förutsägbarheten av läkemedelseffekt, förutom att möjliggöra karakterisering av problem med läkemedel som misslyckades i senare faser av läkemedelsutveckling7.
I lungan utsätts dock slemhinnans epitel för luft. Dessutom immunceller som finns i luftvägarna, som vävnad makrofager, spelar en viktig roll mot inhalerade patogener eller partiklar8. Makrofager migrera genom de olika cellskikten för att nå bronkiallumen och bekämpa infektionen. Vidare, inandningsläkemedel måste också klara av förekomsten av slem som en ytterligare icke-cellulära inslag av pulmonell luft-blod barriär9. Flera komplexa tredimensionella (3D) in vitro-modeller har faktiskt utvecklats, som syftar till att öka in vivo relevans. Samkultur system inte bara öka komplexiteten i in vitro-system för läkemedelsupptäckt men också göra det möjligt att studera cell-cell interaktioner. Sådan komplexitet har tagits upp i studier om makrofag migration10, frisättningen av antimikrobiella peptider av neutrofiler11, rollen av slem i infektion9, och epitelial cell reaktion på överdriven skada12. Men en pålitlig CF-infekterade in vitro-modell som har den genetiska mutationen i CF, som utsätts för luften (ökad fysiologiska tillstånd), och integrerar immunceller saknas fortfarande.
För att överbrygga denna klyfta beskriver vi ett protokoll för stabil mänsklig 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna. Modellen är konstituerad av mänskliga CF bronkial epitelceller och makrofager, infekterade med P. aeruginosa och kan representera både en diffusional och immunologiska barriär. Med målet att testa anti-infectives på någorlunda hög genomströmning, var denna samkultur etablerad på permeabla filtermembranet av väl platta skär, med hjälp av två mänskliga cellinjer: CFBE41o- och THP-1 monocyt-härledda makrofager. Dessutom, för att så småningom studera nedfallet av aerosolized anti-infectives13, modellen fastställdes vid luft-flytande gränssnittet (ALI) snarare än flytande täckta villkor (LCC).
Som vi rapportera här, denna modell gör det möjligt att bedöma inte bara bakteriell överlevnad på en antibiotikabehandling utan också cell cytotoxicitet, epitelial barriär integritet, makrofag transmigration och inflammatoriska svar, som är väsentliga parametrar för läkemedelsutveckling.
Detta protokoll kombinerar två relevanta celltyper för inhalationsterapi av lungvägarna: makrofager och CF bronkial epitel. Dessa celler är seedade på motsatta sidor av genomsläppliga stödinsatser, vilket möjliggör cellexponering för luft (kallas luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor). Denna samkultur av värdceller är därefter infekterad med P. aeruginosa. Båda värd cellinjer är av mänskligt ursprung: epitelceller representerar cystisk fibros bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o-), och THP-114 celler är en väl karakteriserad makrofag-liknande cellinje. Ett konfluentepitelskikt får först bildas på den övre sidan av brunnsplåtsinsatser innan de makrofagliknande cellerna tillsätts till det motsatta facket. När samkulturen är etablerad vid ALI, systemet är inokuleras med P. aeruginosa vid den apikala sidan. Detta infekterade co-culture system används sedan för att bedöma effekten av ett antibiotikum, t ex tobramycin. Följande end-points analyseras: epitelial barriärintegritet vad gäller transepitelialt elektriskt motstånd (TEER), visualisering av cell-cell- och cell-bakterieinteraktioner genom confocal laserscanningsmikroskopi (CLSM), bakterieöverlevnad genom räkning av kolonibildande enheter (CFU), värdcellsöverlevnad (cytotoxicitet) och cytokinfrisättning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1308px;" width="1306">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Accutase</td>
			<td style="width:525px;">Accutase</td>
			<td style="width:205px;">AT104</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY TT Cell Counter and Analyzer</td>
			<td>OLS Omni Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Far Red</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>C34564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Universal 320R</td>
			<td>Hettich, Germany</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CFBE41o- cells</td>
			<td style="width:525px;">1. Gruenert Cell Line Distribution Program 
			2. Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 
			2. SCC151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM</td>
			<td>Leica, Mannheim, Germany</td>
			<td>TCS SP 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits</td>
			<td>Affymetrix eBioscience, USA</td>
			<td>15541037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokines Panel I and II</td>
			<td>LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).</td>
			<td>740102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+) Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>47829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments, Sarasota, USA</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0&#956;m Transparent PET Membrane, Sterile</td>
			<td>Corning, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle</td>
			<td>Roche, Mannheim, Germany</td>
			<td>10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11095072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P. aeruginosa strain PAO1-GFP</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10145GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%</td>
			<td>EMS DIASUM</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffer solution buffer</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Cover Glasses</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)</td>
			<td>Normax, Portugal</td>
			<td>5058561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 culture flasks</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">THP-1 cells</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)</td>
			<td>No. ACC-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tobramycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1783-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

p. aeruginosa infected 3d co-culture of bronchial epithelial cells and macrophages at air-liquid interface for preclinical evaluation of anti-infectives

fDrug forskning för behandling av lunginfektioner går mot prediktiva in vitro-modeller av hög komplexitet. Den mångfacetterade närvaron av bakterier i lungmodeller kan åter anpassa epitelarrangemang, medan immunceller samordnar ett inflammatoriskt svar mot bakterierna i mikromiljö. Medan in vivo-modeller har varit valet för att testa nya anti-infectives i samband med cystisk fibros, de fortfarande inte exakt efterlikna in vivo villkor av sådana sjukdomar hos människor och behandlingsresultaten. Komplexa in vitro-modeller av de infekterade luftvägarna baserade på mänskliga celler (bronkial epitelial och makrofager) och relevanta patogener skulle kunna överbrygga denna klyfta och underlätta översättningen av nya anti-infectives till kliniken. För sådana ändamål har en co-kultur modell av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o- och THP-1 monocyte-derived makrofager har fastställts, härma en infektion i människors bronkial slemhinna av P. aeruginosa vid luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor. Denna modell är inställd i sju dagar, och följande parametrar samtidigt bedömas: epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakteriell överlevnad, och inflammation. Det föreliggande protokollet beskriver ett robust och reproducerbart system för utvärdering av läkemedelseffekt och värdsvar som kan vara relevanta för att upptäcka nya anti-infectives och optimera deras aerosolleverans till lungorna.

Figur 1A visar morfologin av den resulterande samkulturen av mänskliga bronkial epitelceller och makrofager efter växande både för 24 h på den apikala och basolaterala sidan av permeabla stöd, respektive. Epitelial barriärintegriteten visas genom högre TEER (834 Ω×cm2) och CLSM genom immunfärgning för den snäva korsningen proteinET ZO-1 (Bild 1B). Samma resultat som observerats i termer av barriärintegritet av oinfekterade CFBE41o-<...

Watch this Scientific Journal Video about P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives at Jo

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Vi beskriver ett protokoll för en tredimensionell samkultur modell av infekterade luftvägar, med hjälp av CFBE41o- celler, THP-1 makrofager och Pseudomonas aeruginosa, som fastställts vid luft-flytande gränssnittet. Denna modell ger en ny plattform för att samtidigt testa antibiotikaeffekt, epitelial barriärfunktion och inflammatoriska markörer.

P. aeruginosa Infekterade 3D Co-Kultur av Bronkial Epitelial celler och makrofager på Air-Liquid Interface för preklinisk utvärdering av Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Så när vi utvärderar nya anti-infectives, måste vi ta itu med två saker. Ena sidan är bakterierna. Om de är planktoniska eller informerade biofilmer, är den andra sidan närvaron av värdceller, särskilt epitelial värdceller, som bildar snäva biologiska hinder.Om dessa hinder verkställs, hur det monologiska svaret kan vara, och med denna nya modell, kan vi faktiskt övervaka båda parametrarna samtidigt. Vid behandling av bakteriella infektioner måste vi inse vad organ påverkas. Till exempel, om det är lungan, kan vi dra nytta, och lokalt administrera läkemedlet som en aerosol.Men om vi vill ha en modell för att studera detta, behöver vi en modell som också tillåter positionen för aerosoler vilket är fallet i vår modell. Den andra fördelen är att det är baserat på mänskliga celler, så att vi kan undvika problem på grund av skillnader till djur och arter skillnader. Detta system kan ge dig mer insikt i området infektion forskning genom att sprida ljus över molekylära och cellulära händelser under samspelet mellan värdceller och bakterier.När du försöker detta protokoll för första gången, kom ihåg att kontrollera cellmediet för sterilitet och cell morfologi och att vara försiktig när du hanterar de genomsläppliga stöd. Odla CFBE41 O minus celler i en T 75 kolv med minsta essentiella medium som innehåller 10%FCS, 1%icke-essentiella aminosyror, och 600 milligram per liter glukos vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Tillsätt färskt medium till cellerna varannan till var tredje dag.Efter att cellerna nått 70%konfluency, tvätta dem med 10 milliliter PBS och lossna med tre milliliter trypsin EDTA vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Tillsätt sedan sju milliliter färsk MEM och centrifug cellerna vid 300 gånger G i fyra minuter. Efter att ha kastat supernatanten, vid 10 milliliter MEM, samtidigt som de stör klumparna med mild pipettering.Räkna cellerna med en automatiserad cellräknare eller Hemocytometerkammare, späd dem sedan till en koncentration på 200, 000 celler per 500 mikroliter för sådd i 12 brunnsplattor med genomsläppliga stöd. Lägg till 500 mikroliter av cellupphängningen per brunn till den apikala sidan av det permeabla stödet. Tillsätt sedan 1,5 milliliter färskt medium till den basala laterala sidan.Inkubera cellerna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 72 timmar. På den tredje dagen efter sådd, skapa en luft flytande gränssnitt genom att ta bort mediet från den basala laterala sidan först sedan från den apikala sidan. Tillsätt 500 mikroliter av färsk MEM till den basala laterala sidan och ändra mediet varannan dag tills cellerna bildar en konfluent monolayer.För att bedöma cellernas epitelbarriäregenskaper, tillsätt 500 mikroliter cellmedium till den apikala sidan, och 1,5 milliliter till den basala laterala sidan, sedan tillbaka plattan till inkubatorn i en timme. Mät transitmaterialet elektriskt motstånd eller TEER med ann STX2 chopstick elektrod och en epitelvoltvolt ohm meter. För att odla THP1-celler, odla dem i T 75-kolven med hjälp av RPMI 1640 medium, kompletterat med 10%FCS vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Dela upp cellerna varannan dag genom att så 2 miljoner celler per milliliter i en ny T75-kolv. För att differentiera THP1-cellerna, centrifugera kolvens innehåll vid 300 gånger G i fyra minuter, kassera supernatanten. Resuspend pelleten i färskt medium och sätta i en ny T75 kolv.Tillsätt 10 nanogram per milliliter PMA till cellerna och återföra dem till inkubatorn. För att lossa makrofag som celler, tvätta dem en gång med PBS vid 37 grader Celsius, och inkubera dem med tre milliliter cellavlossningslösning som innehåller 0,5 millimolar EDTA i 10 minuter vid rumstemperatur. Kontrollera om cellavlossningen är under ett inverterat mikroskop.När cellerna har lossnat, tillsätt sju milliliter färskt medium och centrifug dem på 300 gånger G i fyra minuter. Efter att ha tagit bort supernatanten, resuspend makrofagcellerna i tre milliliter av THP1 medium i en 15 milliliter konisk slang, räkna cellerna, och inkubera dem i högst en timme innan du ställer upp samkultur. För att upprätta en epitel makrofag samkultur, ta bort mediet från den nedre kammaren av CFBE41 O minus monolayers och försiktigt invertera stödet inuti en steril glas Petriskål, använd en cell skrapa för att avlägsna cellerna övervuxna genom membranet porerna.Placera 200, 000 THP1 makrofager i 200 mikroliter av RPMI på den basala laterala sidan av inverterade insats i varje brunn, stäng Petri-rätter, och inkubera dem i två timmar. Placera sedan skären tillbaka i de 12 brunnsmikroplattorna och tillsätt 500 mikroliter mem-medium till den basala laterala sidan av den genomsläppliga skäret. Inokulera 15 milliliter lb kompletteras med 300 mikrogram per milliliter ampicillin med en enda koloni av P aeruginosa, PAO1GFP, inkubera bakterierna i 18 timmar vid 37 grader Celsius, medan skakar vid 180 RPM.Efter inkubationen, överför bakterierna till en 50 milliliter koniska rör, och centrifuger vid 3, 850 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 10 milliliter steril PBS som har förvärmts till 37 grader Celsius. Mät optisk densitet vid 600 nanometer och justera koncentrationen av bakterier med cellodlingsmediet till en slutkoncentration på 200, 000 kolonibildande enheter per milliliter, vilket motsvarar en multiplicity av infektion av en bakterie per epitelcell.Tillsätt 100 mikroliter bakteriell suspension till den apikala sidan av det permeabla stödet och inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i en timme för att bakterier ska kunna fästa på cellerna, ta sedan försiktigt bort apikal vätska med en pipett för att återställa ALI-förhållanden. För experiment med läkemedelsbehandling, tillsätt 500 mikroliter av en läkemedelslösning utspädd i cellmedium till den apikala sidan. Tillsätt sedan 1,5 milliliter cellmedium till den basala laterala sidan.Samla in 500 mikroliter av det atypiska och basala laterala mediet och poola dem för att bedöma CFU av icke-bifogade bakterier. För att bedöma överlevnaden av bifogade eller internaliserade bakterier, tillsätt 500 mikroliter av sterilt avjoniserat kallt vatten till varje fack av det genomsläppliga stödet, och inkubera cellerna i 30 minuter vid rumstemperatur. Om man bedömer CFU från frysta prover, tina dem vid 37 grader Celsius i 10 minuter.Använd sedan pipettspetsar för att skrapa membranytan och se till att inte sätta för mycket tryck på brunnarna. Pipetten upp och ner för att ta bort allt följs innehåll. Med bakterien suspension från båda fraktionerna, gör en en till 10 serieutspädning med PBS-interpolering och platta bakterierna på lb agar plattor.Inkubera agarplattorna i 30 grader Celsius i 16 till 72 timmar, räkna sedan kolonierna och beräkna CFU. Morfologin hos den resulterande samkulturen av mänskliga bronkial epitelceller och makrofager på den apikala och basilika laterala sidan av de genomsläppliga stöden visas här. En högre TEER mätning och immunfärgning för den snäva korsningen proteiner ZO1, visat epitelial barriär integritet.För att modellera en bakteriell infektion, P aeruginosa var inokuleras på CFBE41 o minus celler. Makrofager observerades på den apikala sidan av samkulturen sex timmar efter infektion. TEER sjönk till 250 ohm per centimeter i kvadrat, vilket tyder på en komprometterad epitelial barriär, som också föreslogs av ZO1 färgning.Makrofagtransmigration genom de genomsläppliga filterporerna och bakterieupptaget av THP-1-celler på den apikala sidan visas här. I monokulturerna THP-1, makrofagmigration så tidigt som en timme efter infektion. Under tiden sågs migrationen efter tre timmar efter infektion i samkulturen.Infekterade co-kulturer behandlas med tobramycin i sex eller 20 timmar var avbildade med confocal scanning laser mikroskopi. Utan behandling dog antingen epitelcellerna eller makrofager efter 20 timmars infektion. Trots att ses efter sex timmars behandling i mikroskopi bilder, en CFU analys visade att bakterierna inte föröka sig.Ändå återhämtade bakterierna sin spridning förmåga efter 20 timmars behandling. TEER av monokulturer och co kulturer mättes också. Samkulturen av CFBE41 o minus celler med THP-1 inducerar inte några förändringar i epitelbarriären integritet jämfört med monokulturen.Vid infektion sjönk TEER-värdet. när du utför detta förfarande är det viktigt att se till att cellerna sitter ordentligt och filtermembranet inte störs. Därför cellen sådd steg måste utföras noggrant.Utöver detta protokoll, nebulisering av antibiotika på skären skulle göra det möjligt att se om bakterier överlevnad förändringar jämfört med nedsänkta villkor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Fastställande av tolerabla fettsyror och kolera Koncentrationer Toxin Använda Human tarmepitelceller och BALB / c Macrophages Mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...