Name: a planarian motility assay to gauge the biomodulating properties of natural products
Uploaded: 2020-05-30T14:00:00
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Gli autori desiderano riconoscere l'ufficio di promozione istituzionale, e la Morrisville College Foundation per una sovvenzione di pubblicazione a sostegno di questo lavoro, così come il SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) per la loro assistenza continua e il sostegno della ricerca universitaria a SUNY Morrisville. Desideriamo anche ringraziare Sophia Hutchens per i commenti utili sulla tecnica descritta.

1. Allevamento planaria
<ol><li>Utilizzare planarini acquistati da una società di fornitura biologica o selvatici catturati se necessario. I planari utilizzati in questo protocollo sono Dugesia tigrina, come elencato nella lista di fornitura. Questa specie è anche indicata come Girardia tigrina31. Altre specie planariari acquatiche sono accettabilianche 2,3. NOTA: Il protocollo descritto è orientato agli animali a...

<ol>
	<li>Moustakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guarana+provides+additional+stimulation+over+caffeine+alone+in+the+planarian+model.">Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model.</a> PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).</li><li>Raffa, R. B., Valdez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+withdrawal+in+Planaria.">Cocaine withdrawal in Planaria.</a> European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).</li><li>Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+dopamine+D2+antagonist+activity+using+invertebrate+(Planaria)+locomotion+as+a+functional+endpoint.">Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint.</a> Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).</li><li>Thum&#233;, I. S., Frizzo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertraline+induces+toxicity+and+behavioral+alternations+in+planarians.">Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians.</a> Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).</li><li>Aggarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+allosteric+modulator+of+the+human+dopamine+transporter.">Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).</li><li>Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+produces+withdrawal+and+dompamine-sensitive+reinforcing+effects+in+planarians.">Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians.</a> Physiology &amp; Behavior. , 8-13 (2013).</li><li>Zewde, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLDT+(planarian+light/dark+test):+an+invertebrate+assay+to+quantify+defensive+responding+and+study+anxiety-like+effects.">PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).</li><li>Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM+Imaging+and+FIMtrack:+two+new+tools+allowing+high-throughput+and+cost+effective+locomotion+analysis.">FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).</li><li>Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function.">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 7 (2015).</li><li>Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+planarians+as+an+alternative+animal+model+for+neurotoxicology.">Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology.</a> Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).</li><li>Risse, B., Berh, D., Otto, N., Kl&#228;mbt, C., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIMtrack:+an+open+source+tracking+and+locomotion+analysis+software+for+small+animals.">FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals.</a> PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).</li><li>Pag&#225;n, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planaria:+an+animal+model+that+integrates+development,+regeneration+and+pharmacology.">Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology.</a> International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).</li><li>Palladini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+cocaine+activity+in+planaria.">A pharmacological study of cocaine activity in planaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).</li><li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians:+translation+to+mammals.">Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology &amp; Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergeric+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).</li><li>Raffa, R. B., Rawls, S. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarians+as+models+of+cadmium-induced+neoplasia+provide+measurable+benchmarks+for+mechanistic+studies.">Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).</li><li>Van Roten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carcinogenic+trigger+to+study+the+function+of+tumor+suppressor+genes+in+Schmedtea+mediterranea.">A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea.</a> Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).</li><li>Mason, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrical+response+of+the+planarian+ocellus.">The electrical response of the planarian ocellus.</a> Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).</li><li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis.">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).</li><li>Byrne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ethanol+on+negative+phototaxis+and+motility+in+brown+planarians+(Dugesia+tigrina).">Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina).</a> Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).</li><li>de Sousa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+planarians+under+simulated+microgravity+or+8g+demonstrates+that+alteration+of+gravity+induces+genomic+and+cellular+alterations+that+could+facilitate+tumoral+transformation.">Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).</li><li>Best, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+organ+trail:+insights+into+organ+regeneration+in+the+planarian.">On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 37-46 (2015).</li><li>Ivancovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+planarians.">Model systems for regeneration: planarians.</a> Development. 146 (17), 167684 (2019).</li><li>Herath, S., Lobo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-inhibition+of+Turing+patterns+explains+the+self-organized+regulatory+mechanism+of+planarian+fission.">Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission.</a> Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).</li><li>Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+melatonin-synthesizing+enzyme+activities+and+melatonin+levels+in+planarians.">Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians.</a> Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).</li><li>Itoh, M. T., Igarashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+serotonin+levels+in+planarians.">Circadian rhythm of serotonin levels in planarians.</a> Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).</li><li>Hinrichsen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+and+motility+in+planarian+Schmedtea+mediterranea+vary+diurnally.">Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally.</a> Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).</li><li>Raffa, R. B., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+and+quantification+of+cocaine+withdrawal+signs+in+planaria.">Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria.</a> Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).</li><li>Pag&#225;n, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cembranoid+from+tobacco+prevents+the+expression+of+induced+withdrawal+behavior+in+planarian+worms.">A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms.</a> European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).</li><li>Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+that+drugs+of+abuse+produce+behavioral+sensitization+and+cross-sensitization+in+planarians.">First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians.</a> Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).</li><li>Venturini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+dopaminergic+receptors+in+planaria.">A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria.</a> Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).</li><li>Ouyang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+Spenda,+Equal+and+sucrose:+Clues+from+planarians+on+sweeteners.">Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners.</a> Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).</li><li>Pag&#225;n, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+nicotine-induced,+curare-sensitive,+behavior+in+planarians.">Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians.</a> Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).</li><li>Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+planarians:+feeding+and+injection+of+synthetic+dsRNA.">RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).</li><li>Pag&#225;n, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cocaine-induced+planarian+behavior+by+parthenolide+and+related+sesquiterpene+lactones.">Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).</li><li>Vouga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereochemistry+and+neuropharmacology+of+a+'bath+salt'+cathinone:+S-enantiomer+of+mephedrone+reduces+cocaine-induced+reward+and+withdrawal+in+invertebrates.">Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates.</a> Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).</li><li>Chan, J. D., Marchant, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+and+functional+genetic+assays+to+manipulate+regeneration+of+the+planarian+Dugesia+japonica.">Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).</li></ol>

Un semplice e accessibile analisi della motilità planaria è descritto per determinare gli effetti stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. Come modello comportamentale è necessario disporre di protocolli rigorosi per il movimento del punteggio e definizioni chiare di eventuali comportamenti per standardizzare le osservazioni tra diversi sperimentatori. Le idee presentate offrono una dimostrazione di come questo può essere raggiunto. Ogni laboratorio che utilizza questo protocollo deve adattare le informazioni pr...

Il protocollo descritto utilizza la motilità planaria per fornire un mezzo per valutare gli effetti biomodulanti delle sostanze naturali. È stato specificamente adattato per determinare se queste sostanze funzionano come stimolanti, e se poi sono stati associati con un comportamento di astinenza misurabile1. Questo saggio, noto come il test di velocità locomotore planaria (pLmV), è stato utilizzato per testare noti agenti farmacologici2,3. L'applicazione di questo saggio planaria basato sulla motilità è da allora cresciuta in popolarità ed è stato adottato da diversi laboratori interessati a sostanze diverse dai prodottinaturali 4,5. Per questo esempio, un planariario viene posto in un piatto Petri contenente acqua di sorgente o acqua di sorgente contenente un biomodulatore disciolto. Poiché il piatto stesso è posto su carta millimetrata, il numero di linee della griglia attraversate dall'animale con il tempo mentre si muove sul contenitore può essere utilizzato per determinare la velocità di movimento in ogni condizione. Il test chiaro/scuro, altrimenti indicato come il test di preferenza posto condizionato (CPP), è un'altra variazione sul tema del monitoraggio della motilità planaria, e valuta quanto velocemente gli animali rispondono e migrano in un ambiente oscurato6,7. Il tracciamento video dei movimenti planari può anche essere analizzato utilizzando programmi informatici e il monitoraggio del centro di massa (COM)8,9,10,11.
L'utilizzo del planariano come modello animale per tali studi offre diversi vantaggi rispetto ad altri animali in quanto lo sperimentatore può facilmente controllare l'ambiente di analisi. In particolare, morire di fame i planariani prima della sperimentazione può impedire la loro esposizione ad altri agenti nutrizionali o farmacologici che potrebbero altrimenti confondere i risultati, e il biomodulatore specifico in esame può essere introdotto ai planari semplicemente aggiungendolo direttamente all'acqua di coltura, standardizzando così l'esposizione. Dal momento che i planari hanno un sistema nervoso e neurotrasmettitori che ricordano gli animali di ordine superiore, la fisiologia e le risposte sperimentali di questi animali agli stimoli neuromuscolari sono considerati biologicamente rilevanti per altri organismi12,13,14,15,16. Inoltre, poiché i planari sono relativamente economici e semplici da mantenere in laboratorio, offrono un modello biologico accessibile per molti ricercatori.
Come animale sperimentale, i planari sono adatti a una vasta gamma di studi. Ad esempio, il nostro gruppo, così come altri ricercatori utilizzano planariani per studiare la tumorigenesi17,18,19. I planariani presentano anche una serie di comportamenti di risposta agli stimoli chimici, termici, gravitazionali, elettrici, fotografici e magnetici che hanno costituito la base di altri sistemi di analisi. Alcuni di questi effetti sono stati utilizzati per studiare l'apprendimento e la memoria in questianimali 20,21,22,23,24,25,26,27. L'uso primario del modello planaria nella letteratura attualmente si concentra sull'attività delle cellule staminali pluripotenti planariari, chiamate neoblasti, e sul loro ruolo nellarigenerazione 28,29,30. Così, l'adozione del modello qui descritto consente un ulteriore studio utilizzando altri saggi a base planaria per fornire una comprensione più ampia di come i prodotti naturali e altri biomodulatori influenzano l'organismo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bottled Water - 1 Gal.</td>
			<td>Poland Spring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spring water for planarian culture and to prepare solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Planaria (Dugesia tigrina)</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>132954</td>
			<td>Brown planaria living (other species are acceptable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Paintbrush</td>
			<td>Royal Crafter&#39;s Choice</td>
			<td>9159</td>
			<td>Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish - 10 cm</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish - 5 cm</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Paper</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPEVO Visualizer (software)</td>
			<td>iPEVO</td>
			<td>https://www.ipevo.com/software/visualizer</td>
			<td>Document camera software for video capture and recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metalware Set with Support Stand and Retort Ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Egg</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Organic egg or beef liver for feeding planarains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Storage Container - 10 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Water Paint Brush</td>
			<td>LOEW-Cornell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Document Camera</td>
			<td>iPEVO</td>
			<td>CDVU-06IP</td>
			<td>Document camera (or other camera or cell phone camera)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a planarian motility assay to gauge the biomodulating properties of natural products

Viene descritto un mezzo semplice e controllabile per utilizzare il planariano non parassita, Dugesia tigrina, un verme piatto acquatico vivente, per studiare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. I saggi sperimentali che beneficiano di aspetti unici della fisiologia planaria sono stati applicati agli studi sulla guarigione delle ferite, la rigenerazione e la tumorigenesi. Inoltre, poiché i planari mostrano sensibilità a una varietà di stimoli ambientali e sono in grado di apprendere e sviluppare risposte condizionate, possono essere utilizzati in studi comportamentali che esaminano l'apprendimento e la memoria. I planari possiedono una simmetria bilaterale di base e un sistema nervoso centrale che utilizza sistemi di neurotrasmettitori su cui è possibile studi che esaminano gli effetti dei biomodulatori neuromuscolari. Di conseguenza, sono stati sviluppati sistemi sperimentali che monitorano il movimento planaria e la motilità per esaminare la dipendenza da sostanze e il ritiro. Poiché la motilità planaria offre il potenziale per un sistema di analisi della motilità sensibile e facilmente standardizzato per monitorare l'effetto degli stimoli, il test di velocità del locomotore planaria (pLmV) è stato adattato per monitorare sia i comportamenti di stimolazione che di ritiro da parte dei planari attraverso la determinazione del numero di linee di griglia attraversate dagli animali con il tempo. Qui, la tecnica e la sua applicazione sono dimostrati e spiegati.

Il laboratorio istituito e la preparazione dello spazio di lavoro per l'esecuzione del test pLmV devono essere completati prima dell'inizio della sperimentazione. Ciò include la preparazione del contenitore di assunta, del contenitore di risciacquo se necessario (per gli esperimenti di ritiro), della piastra Petri sulla carta griglia laminata e della telecamera posizionata correttamente (Figura 1). Una volta che tutti i video sono presi, si consiglia di utilizzare un foglio dati comune per ...

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A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

La motilità planaria viene utilizzata per misurare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali rispetto al movimento degli animali solo nell'acqua di sorgente.

Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Il Planarian Locomotor Velocity Test è un mezzo per valutare rapidamente gli stimolanti e i possibili effetti di astinenza per una varietà di agenti di modifica biologica che potrebbero influenzare la motilità. Questo saggio è facilmente controllabile e fornisce un metodo semplice e accessibile per generare dati comportamentali affidabili anche nelle impostazioni di ricerca più basilali. Poiché il sistema nervoso planaria ha un cervello rudimentale centralizzato, una simmetria bilaterale e sistemi di neurotrasmettitori analoghi, gli studi comportamentali che utilizzano questi organismi offrono intuizioni precliniche su possibili risposte ai vertebrati.Gli esperimenti possono essere ulteriormente influenzati da modificatori fisiologici delle vie, farmaci o persino planari geneticamente modificati per fornire informazioni sui meccanismi biologici associati. È importante avere il planario in modo che i trasferimenti tra contenitori non li stressno e standardizzare le curve della linea della griglia tra i membri del lab. Il modo migliore per ottenere risultati coerenti da questo esperimento di saggio sul comportamento, è vedere come gli utenti esperti li hanno eseguiti.Dopo aver impostato una coltura planariana, nutrire i vermi ad libitum con un programma regolare due volte a settimana di uova sode biologiche tritate o fegato di manzo biologico miscelato per una o due ore. Dopo l'alimentazione, rimuovere l'acqua sporca dal contenitore e utilizzare una spazzola di vernice ad acquerello piatta per trasferire eventuali detriti alimentari e melma che aderiscono al contenitore a un tovagliolo di carta. Utilizzare acqua di sorgente fresca e un delicato vorticoso o agitazione per spostare i planari e decampare i vermi in un contenitore pulito.Far scorrere una punta di pipetta a foro largo sotto tutti i planarini rimasti aderenti al vecchio contenitore per facilitarne il trasferimento al nuovo piatto e decantare attentamente l'acqua di trasferimento. Quindi, coprire i planari nel nuovo contenitore con acqua di sorgente fresca. Per eseguire un test planario locomotore, assicurarsi innanzitutto che i planari affamati da cinque a 10 giorni siano completamente formati con teste e code complete e pigmentate.Se i planari sono pronti, posizionare una piastra di Petri pulita di 10 centimetri di diametro su un pezzo di carta griglia pre laminata con quadrati di 0,5 centimetri per gruppo sperimentale e aggiungere 20 millilitri di acqua di sorgente non adulterata per il gruppo di controllo o 20 millilitri di acqua di sorgente contenenti l'appropriata concentrazione del prodotto naturale in fase di test su ogni piatto. Posizionare una telecamera sopra la piastra di stimolazione della velocità locomotoria preparata e aggiungere da cinque a 10 millilitri di acqua di sorgente non adulterata o acqua di sorgente contenente l'appropriata concentrazione del composto sperimentale in un contenitore di assuazione di dimensioni adeguate. Successivamente, utilizzare un piccolo pennello ad acquerello pulito per trasferire delicatamente un planariano dal contenitore di coltura al contenitore di assunzione preparato e consentire al planariano di abituarsi alla soluzione nel contenitore per due minuti.La ricerca consentirà ai planari di passare al pennello e sollevare attentamente gli animali senza forzarli. Al termine del periodo di assunzione, utilizzare il pennello per trasferire con cura il planario al centro del piatto di stimolazione della velocità locomotoria preparato contenente la stessa soluzione del contenitore di assuazione e avviare la fotocamera per registrare da 10 a 11 minuti di movimento del planario. Per testare gli effetti del ritiro alla fine del periodo di assuazione, sciacquare il planario in un piatto di cinque centimetri contenente solo acqua di sorgente.Prima di trasferire il verme al centro del piatto di velocità locomotore preparato contenente acqua di sorgente fresca e avviare la fotocamera per registrare da 10 a 11 minuti di movimento. La configurazione della telecamera consente una visione chiara della carta planaria e della griglia e consente una valutazione accurata dello stato di avanzamento dell'animale per tutta la durata dell'esperimento. La raccolta dei dati deve includere il numero totale di linee della griglia attraversate e il numero totale cumulativo di linee attraversate al minuto dell'esperimento.Per standardizzare i risultati di ogni prova, le corse di velocità locomotoria planaria possono essere calcolate e tracciate come il numero di scatole incrociate rispetto allo stato di avanzamento del worm di controllo corrispondente. Come punto di riferimento, i planari nell'acqua di sorgente coprono in genere circa 25 scatole in tre minuti. Una serie di concentrazioni di reagenti di prova può essere esaminata per determinare la motilità planaria in risposta ai composti di prova di interesse.I dati di prelievo possono essere valutati quantificando il numero di linee di rete attraversate nell'acqua di sorgente rispetto al controllo delle acque di sorgente dopo che gli animali sono stati abituati nel prodotto biomodulante in esame. I planari di controllo dell'acqua di sorgente si spostano sulle linee della rete per tutta la durata dell'esperimento. A volte, tuttavia, i planari di prova cessano di attraversare le linee della griglia durante il saggio con comportamenti caratteristici per il prodotto in fase di test.Ciò suggerisce che potrebbe essere necessario un metodo di analisi diverso. Tali casi possono essere monitorati e i dati possono essere illustrati come la percentuale del numero totale di animali esposti a una particolare concentrazione di reagenti. È essenziale gestire il planario in modo che non siano danneggiati durante il trasferimento tra i piatti.Dopo aver determinato gli effetti delle diverse concentrazioni di un prodotto naturale, è possibile aggiungere modificatori di vie biologiche per osservare eventuali cambiamenti dinamici ai risultati iniziali. Il test planario della velocità locomotoria è stato utilizzato per testare la stimolazione e il ritiro utilizzando agenti farmacologici noti. Abbiamo adattato il sistema per studiare questi stessi concetti con prodotti naturali.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Un laser Rapid Probing Metodo Facilita la determinazione non invasiva e senza contatto di Leaf Proprietà termiche

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Ricerca

Biochimica

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The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

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Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato

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Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

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Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

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Lipidomica shotgun di tessuti di roditori

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