Name: a planarian motility assay to gauge the biomodulating properties of natural products
Uploaded: 2020-05-30T14:00:00
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Los autores desean reconocer a la oficina de Avance Institucional, y a la Morrisville College Foundation por una subvención de publicación para apoyar este trabajo, así como al SunY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) por su asistencia continua y apoyo a la investigación de pregrado en SUNY Morrisville. También queremos agradecer a Sophia Hutchens por sus útiles comentarios sobre la técnica descrita.

1. La cría plana
<ol><li>Utilice planarios comprados a una empresa de suministro biológico o capturados salvajemente si es necesario. Los planarios utilizados en este protocolo son Dugesia tigrina,como se indica en la lista de suministros. Esta especie también se conoce como Girardia tigrina31. Otras especies planarias acuáticas también son aceptables2,3. NOTA: El protocolo descrito está orientado a animales co...

<ol>
	<li>Moustakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guarana+provides+additional+stimulation+over+caffeine+alone+in+the+planarian+model.">Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model.</a> PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).</li><li>Raffa, R. B., Valdez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+withdrawal+in+Planaria.">Cocaine withdrawal in Planaria.</a> European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).</li><li>Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+dopamine+D2+antagonist+activity+using+invertebrate+(Planaria)+locomotion+as+a+functional+endpoint.">Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint.</a> Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).</li><li>Thum&#233;, I. S., Frizzo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertraline+induces+toxicity+and+behavioral+alternations+in+planarians.">Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians.</a> Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).</li><li>Aggarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+allosteric+modulator+of+the+human+dopamine+transporter.">Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).</li><li>Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+produces+withdrawal+and+dompamine-sensitive+reinforcing+effects+in+planarians.">Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians.</a> Physiology &amp; Behavior. , 8-13 (2013).</li><li>Zewde, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLDT+(planarian+light/dark+test):+an+invertebrate+assay+to+quantify+defensive+responding+and+study+anxiety-like+effects.">PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).</li><li>Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM+Imaging+and+FIMtrack:+two+new+tools+allowing+high-throughput+and+cost+effective+locomotion+analysis.">FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).</li><li>Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function.">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 7 (2015).</li><li>Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians:+translation+to+mammals.">Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology &amp; Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergeric+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).</li><li>Raffa, R. B., Rawls, S. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarians+as+models+of+cadmium-induced+neoplasia+provide+measurable+benchmarks+for+mechanistic+studies.">Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).</li><li>Van Roten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carcinogenic+trigger+to+study+the+function+of+tumor+suppressor+genes+in+Schmedtea+mediterranea.">A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea.</a> Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).</li><li>Mason, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+organ+trail:+insights+into+organ+regeneration+in+the+planarian.">On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 37-46 (2015).</li><li>Ivancovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+planarians.">Model systems for regeneration: planarians.</a> Development. 146 (17), 167684 (2019).</li><li>Herath, S., Lobo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-inhibition+of+Turing+patterns+explains+the+self-organized+regulatory+mechanism+of+planarian+fission.">Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission.</a> Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).</li><li>Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+melatonin-synthesizing+enzyme+activities+and+melatonin+levels+in+planarians.">Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians.</a> Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).</li><li>Itoh, M. T., Igarashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+serotonin+levels+in+planarians.">Circadian rhythm of serotonin levels in planarians.</a> Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).</li><li>Hinrichsen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+and+motility+in+planarian+Schmedtea+mediterranea+vary+diurnally.">Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally.</a> Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).</li><li>Raffa, R. B., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+and+quantification+of+cocaine+withdrawal+signs+in+planaria.">Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria.</a> Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).</li><li>Pag&#225;n, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cembranoid+from+tobacco+prevents+the+expression+of+induced+withdrawal+behavior+in+planarian+worms.">A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms.</a> European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).</li><li>Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. 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R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+nicotine-induced,+curare-sensitive,+behavior+in+planarians.">Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians.</a> Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).</li><li>Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+planarians:+feeding+and+injection+of+synthetic+dsRNA.">RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).</li><li>Pag&#225;n, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cocaine-induced+planarian+behavior+by+parthenolide+and+related+sesquiterpene+lactones.">Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).</li><li>Vouga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereochemistry+and+neuropharmacology+of+a+'bath+salt'+cathinone:+S-enantiomer+of+mephedrone+reduces+cocaine-induced+reward+and+withdrawal+in+invertebrates.">Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates.</a> Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).</li><li>Chan, J. D., Marchant, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+and+functional+genetic+assays+to+manipulate+regeneration+of+the+planarian+Dugesia+japonica.">Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).</li></ol>

Se describe un ensayo de motilidad planaria sencillo y accesible para determinar los efectos estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Como modelo de comportamiento es necesario tener protocolos estrictos para el movimiento de puntuación y definiciones claras de cualquier comportamiento para estandarizar las observaciones entre diferentes experimentadores. Las ideas presentadas ofrecen una demostración de cómo se puede lograr esto. Cada laboratorio que utilice este protocolo debe adaptar la informació...

El protocolo descrito utiliza la motilidad planaria para proporcionar un medio de evaluar los efectos biomoduladores de las sustancias naturales. Se adaptó específicamente para determinar si estas sustancias funcionan como estimulantes, y si entonces se asociaron con un comportamiento de abstinencia mensurable1. Este ensayo, conocido como la prueba de velocidad del locomotor planorio (pLmV), se utilizó por primera vez para probar agentes farmacológicos conocidos2,3. La aplicación de este ensayo plano a base de motilidad ha crecido desde entonces en popularidad y ha sido adoptado por diferentes laboratorios interesados en sustancias distintas de los productos naturales4,,5. Para este ensayo, un planorio se coloca en un plato de Petri que contiene agua de manantial o agua de manantial que contiene un biomodulador disuelto. Debido a que el plato en sí se coloca en papel gráfico, el número de líneas de rejilla cruzadas por el animal con el tiempo a medida que se mueve alrededor del recipiente se puede utilizar para determinar la velocidad de movimiento en cada condición. La prueba de luz/oscuridad, también conocida como la prueba de preferencia de lugar condicionada (CPP), es otra variación en el tema de la supervisión de la motilidad planaria, y evalúa la rapidez con la que los animales responden y migran a un entorno oscuro6,,7. El seguimiento de vídeo de los movimientos planos también se puede analizar utilizando programas informáticos y seguimiento del centro de masa (COM)8,9,10,11.
El uso del planoario como modelo animal para tales estudios ofrece varias ventajas sobre otros animales en que el experimentador puede controlar fácilmente el entorno del ensayo. Específicamente, el hambre de los planarios antes de la experimentación puede impedir su exposición a otros agentes nutricionales o farmacológicos que de otro modo podrían confundir los resultados, y el biomodulador específico bajo investigación se puede introducir a los planarios simplemente agregándolo directamente al agua de cultivo, estandarizando así la exposición. Dado que los planarios tienen un sistema nervioso y neurotransmisores que recuerdan a los animales de orden superior, la fisiología y las respuestas experimentales de estos animales a los estímulos neuromusculares se consideran biológicamente relevantes para otros organismos12,,13,,14,,15,,16. Además, debido a que los planarios son relativamente baratos y sencillos de mantener en el laboratorio, ofrecen un modelo biológico accesible para muchos investigadores.
Como animal experimental, los planarios son adecuados para una amplia gama de estudios. Por ejemplo, nuestro grupo, así como otros investigadores utilizan planarios para estudiar la tumorigenesis17,18,19. Los planarios también exhiben una serie de comportamientos de respuesta a estímulos químicos, térmicos, gravitacionales, eléctricos, fotográficos y magnéticos que han formado la base de otros sistemas de ensayo. Algunos de estos efectos se han utilizado para estudiar el aprendizaje y la memoria en estos animales20,,21,22,23,24,25,26,27. El uso principal del modelo planario en la literatura en la actualidad se centra en la actividad de las células madre pluripotentes planarias, llamadas neoblastos, y su papel en la regeneración28,,29,,30. Por lo tanto, la adopción del modelo descrito aquí permite un estudio más profundo utilizando otros ensayos basados en planarios para proporcionar una comprensión más amplia de cómo los productos naturales y otros biomoduladores afectan al organismo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Bottled Water - 1 Gal.</td>
			<td>Poland Spring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spring water for planarian culture and to prepare solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Planaria (Dugesia tigrina)</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>132954</td>
			<td>Brown planaria living (other species are acceptable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Paintbrush</td>
			<td>Royal Crafter&#39;s Choice</td>
			<td>9159</td>
			<td>Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish - 10 cm</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish - 5 cm</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Paper</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPEVO Visualizer (software)</td>
			<td>iPEVO</td>
			<td>https://www.ipevo.com/software/visualizer</td>
			<td>Document camera software for video capture and recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metalware Set with Support Stand and Retort Ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Egg</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Organic egg or beef liver for feeding planarains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Storage Container - 10 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Water Paint Brush</td>
			<td>LOEW-Cornell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Document Camera</td>
			<td>iPEVO</td>
			<td>CDVU-06IP</td>
			<td>Document camera (or other camera or cell phone camera)</td>
		</tr>
	</tbody>
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a planarian motility assay to gauge the biomodulating properties of natural products

Se describe un medio sencillo y controlable de utilizar el planario no parásito, Dugesia tigrina, un gusano plano acuático de vida libre, para estudiar las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Los ensayos experimentales que se benefician de aspectos únicos de la fisiología planaria se han aplicado a estudios sobre cicatrización de heridas, regeneración y tumorigenesis. Además, debido a que los planarios exhiben sensibilidad a una variedad de estímulos ambientales y son capaces de aprender y desarrollar respuestas condicionadas, se pueden utilizar en estudios conductuales que examinan el aprendizaje y la memoria. Los planarios poseen una simetría bilateral básica y un sistema nervioso central que utiliza sistemas de neurotransmisores susceptibles de estudios que examinan los efectos de los biomoduladores neuromusculares. En consecuencia, se han desarrollado sistemas experimentales de seguimiento del movimiento plano y la motilidad para examinar la adicción y la abstinencia de sustancias. Debido a que la motilidad planaria ofrece la posibilidad de un sistema de ensayo de motilidad sensible y fácilmente estandarizado para monitorear el efecto de los estímulos, la prueba de velocidad locomotora planaria (pLmV) fue adaptada para monitorear los comportamientos de estimulación y abstinencia por parte de planarios a través de la determinación del número de líneas de rejilla cruzadas por los animales con el tiempo. Aquí, la técnica y su aplicación se demuestran y explican.

La configuración del laboratorio y la preparación del espacio de trabajo para ejecutar el ensayo pLmV deben completarse antes de que comience la experimentación. Esto incluye la preparación del recipiente de habituación, el recipiente de enjuague si es necesario (para experimentos de retirada), el plato Petri sobre papel de rejilla laminado y la cámara correctamente colocada(Figura 1). Una vez que se toman todos los videos, es aconsejable utilizar una hoja de datos común para estandar...

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A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

La motilidad planaria se utiliza para medir las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales en comparación con el movimiento de los animales solo en el agua de manantial.

Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

La prueba de velocidad del locomotor de Planarian es un medio para evaluar rápidamente los efectos estimulantes y posibles de abstinencia para una variedad de agentes modificadores biológicos que podrían afectar la motilidad. Este ensayo se controla fácilmente y proporciona un método sencillo y accesible para generar datos de comportamiento fiables incluso en los entornos de investigación más básicos. Dado que el sistema nervioso plano tiene un cerebro rudimentario centralizado, una simetría bilateral y sistemas de neurotransmisores análogos, los estudios conductuales que utilizan estos organismos ofrecen información preclínica sobre posibles respuestas de vertebrados.Los experimentos pueden verse afectados aún más por modificadores de vías fisiológicas, fármacos o incluso planarios modificados genéticamente para proporcionar información sobre los mecanismos biológicos asociados. Es importante tener el planario para que las transferencias entre contenedores no los estreses y para estandarizar las curvas de línea de rejilla entre los miembros del laboratorio. La mejor manera de obtener resultados consistentes de este experimento de ensayo de comportamiento, es viendo cómo los usuarios experimentados los realizaron.Después de establecer un cultivo plano, alimentar a los gusanos ad libitum en un horario regular de dos veces por semana de huevos cocidos orgánicos picados o hígado de res orgánico mezclado durante una o dos horas. Después de la alimentación, retire el agua sucia del recipiente y utilice un cepillo de pintura de acuarela plana para transferir los restos de comida y la baba adherida al recipiente a una toalla de papel. Utilice agua dulce de manantial y suave remolino o agitación para desalojar a los planarios y acampar los gusanos en un recipiente limpio.Deslice una punta de pipeta de diámetro ancho debajo de cualquier planarios que permanezcan adheridos al recipiente antiguo para facilitar su transferencia al nuevo plato y para decantar cuidadosamente el agua de transferencia. A continuación, cubra los planarios en el nuevo recipiente con agua dulce de manantial. Para realizar una prueba de velocidad del locomotor planoiano, primero asegúrese de que los planarios hambrientos de cinco a 10 días estén completamente formados con cabezas y colas completas y pigmentadas.Si los planarios están listos coloque un plato limpio de 10 centímetros de diámetro Petri en una pieza de papel de rejilla prelaminado con cuadrados de 0,5 centímetros por grupo experimental y agregue 20 mililitros de agua de manantial sin adulterar para el grupo de control o 20 mililitros de agua de manantial que contengan la concentración adecuada del producto natural que se está probando en cada plato. Coloque una cámara por encima de la antena paralmotor preparada y añada de cinco a 10 mililitros de agua de manantial no adulterada o agua de manantial que contenga la concentración adecuada del compuesto experimental a un recipiente de habituación de tamaño adecuado. A continuación, utilice un pequeño pincel de acuarela limpia para transferir suavemente un planorio del recipiente de cultivo al recipiente de habituación preparado y permita que el planario habitule a la solución durante dos minutos.La investigación permitirá a los planarios moverse sobre el maleza y levantar cuidadosamente a los animales sin forzarlos. Al final del período de habituación, utilice el cepillo para transferir cuidadosamente el planoario al centro de la antena de estimulación de la velocidad locomotora preparada que contiene la misma solución que el contenedor de habituación e inicie la cámara para grabar de 10 a 11 minutos de movimiento del plano. Para probar los efectos de la abstinencia al final del período de habituación, enjuague el plano en un plato de cinco centímetros que contenga agua de manantial solamente.Antes de transferir el gusano al centro de la antena de velocidad del locomotor preparada que contiene agua de manantial fresca e iniciar la cámara para grabar de 10 a 11 minutos de movimiento. La configuración de la cámara permite una vista clara del papel plano y de la rejilla y permite una evaluación precisa del progreso del animal durante la duración del experimento. La recopilación de datos debe incluir el número total de líneas de cuadrícula cruzadas, así como el número total acumulado de líneas cruzadas por minuto del experimento.Para estandarizar los resultados de cada ensayo, las ejecuciones de velocidad del locomotor plano se pueden calcular y trazar como el número de cajas cruzadas en relación con el progreso del gusano de control coincidente. Como punto de referencia, los planarios en agua de manantial suelen cubrir aproximadamente 25 cajas en tres minutos. Se puede examinar una serie de concentraciones de reactivos de ensayo para determinar la motilidad planaria en respuesta a los compuestos de ensayo de interés.Los datos de retirada pueden evaluarse cuantificando el número de líneas de rejilla cruzadas en el agua de manantial en relación con el control del agua de manantial después de que los animales se hayan habituado en el producto bio modulador que se está examinando. Los planarios de control de agua de manantial se mueven sobre las líneas de rejilla durante el experimento. A veces, sin embargo, los planarios de prueba dejan de cruzar las líneas de cuadrícula durante el ensayo con comportamientos característicos para el producto que se está probando.Esto sugiere que podría ser necesario un método de análisis diferente. Estos casos pueden ser rastreados y los datos pueden ilustrarse como el porcentaje del número total de animales expuestos a una concentración de reactivos particular. Es esencial manipular el plano para que no se dañen durante la transferencia entre platos.Después de determinar los efectos de diferentes concentraciones de un producto natural, se pueden añadir modificadores de vías biológicas para observar cualquier cambio dinámico en los resultados iniciales. La prueba de velocidad del locomotor de Planarian se utilizó para probar la estimulación y la abstinencia utilizando agentes farmacológicos conocidos. Adaptamos el sistema para estudiar estos mismos conceptos con productos naturales.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Investigación

Bioquímica

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...