Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من خلال تمويل من قسم علم الأمراض والطب المختبري، جامعة سينسيناتي، كلية الطب، إلى الدكتور أونور كانيسيك؛ منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01HL148598) إلى الدكتور أونور كانيسيك. الدكتور أونور كانيسيكاك مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية جائزة التطوير الوظيفي (18CDA34110117). الدكتور بيرويز علم مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة ما بعد الدكتوراه (AHA_20POST35200267). الدكتورة مالينا ج. آيفي مدعومة بمنحة من المعاهد القومية للصحة T32 (HL 125204-06A1).

يجب أن يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرها المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة (NIH). وقد وافقت على جميع البروتوكولات المعروضة في الفيديو من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة سينسيناتي، كلية الطب.
<p...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

هناك حاجة ماسة إلى إنشاء بروتوكول لعزلة القلب و الثقافة طويلة الأجل لإجراء دراسات ميكانيكية خاصة بالخلايا. هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تناقش الكبار CM بروتوكولات العزل، وتستخدم أقل منهم حتى لثقافة طويلة الأجل من الفئران الكبار CM15،16،17...

أمراض القلب هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تقريبا جميع أنواع الإصابة القلبية يؤدي إلى فقدان كبير من أمراض القلب الكبار (CMs). قلوب الثدييات الكبار غير قادرين على إصلاح إصابات القلب بسبب الطبيعة الشيخوخة لـ CM البالغ1. وبالتالي، فإن أي إهانة للقلب الثديي البالغين يؤدي إلى فقدان دائم لـ CMs، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة القلب وفشل القلب. على عكس الثدييات الكبار، يمكن للحيوانات الصغيرة مثل حمار وحشي وقلوب نيوت تجديد إصابات القلب من خلال انتشار CM القائمة2،3،4. ويجري بذل جهد عالمي لإيجاد تدخل علاجي جديد للإصابة بالقلب من خلال النهج التكاثرية وغير التكاثرية على حد سواء. في العقود الماضية، تم تطوير أنواع مختلفة من نماذج الماوس الجينية لدراسة إصابة القلب وإصلاح. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج الحيوانات الحية في أن يكون نهجا مكلفا مع تعقيد إضافي لفك آلية الخلية المستقلة من الآثار الثانوية. إلى جانب ذلك، في نظم الجسم الحي هي صعبة لتحليل CM آثار محددة للتدخل الدوائية التي تحفز إشارات القلب من CM.
وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للأجهزة الجماعية للبالغين ضرورية لإجراء تحليلات انتشار الأسلحة العنقودية. تتطلب فحوصات انتشار CM ما لا يقل عن 4-5 أيام حتى يتم تحريض الخلايا في دورة الخلية والحصول على بيانات دقيقة بعد ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات التي تستخدم CMs المعزولة للدراسات الفسيولوجية الكهربائية ، وفحص الأدوية ، ودراسات السمية ، ودراسات Ca++ التوازن كلها في حاجة إلى نظام ثقافة محسن5،6،7. وعلاوة على ذلك، تظهر الدراسات الحديثة أهمية القلبية من السيتوكينات يفرز من CMs (cardiokines)8،9. من أجل التحقيق في الدور العلاجي والآلية الجزيئية لهذه القلب أثناء إصلاح القلب وتجديده ، هناك حاجة إلى ثقافة طويلة.
الكبار الجرذان CMs قوية بما فيه الكفاية لعزلة خلية واحدة والثقافة على المدى الطويل في نظام في المختبر10،11،12. ومع ذلك ، فإن الماوس الكبار CMs هي ذات أهمية كبيرة في المختبرات ، وذلك بسبب توافر مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا ، والذي يسمح لتصميم وتنفيذ مختلف التحليلات المبتكرة التي لا يمكن مع الفئران CM13. على النقيض من الكبار الجرذان CM العزلة ، فإنه من الصعب جدا الحصول على تعليق خلية واحدة من قلوب الماوس الكبار ، وثقافة طويلة الأجل من الكبار الماوس CMs في الثقافة هو أكثر تحديا.
الكبار CM العزلة من قلوب الفئران والماوس باستخدام نظام Langendorff سبق أن أنشئت لدراسة وظيفة CM5،14،15. هنا، وصفنا بالتفصيل بروتوكولات لعزلة CM الكبار عن كل من الفئران والجرذان، فضلا عن الثقافة المعدلة على المدى الطويل، وتكاثر تكاثر CM للخلايا المعزولة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

السابقين فيفو ثقافة من الثدييات الكبار cardiomyocytes (CMs) يقدم النظام التجريبي الأكثر صلة للدراسة في المختبر من بيولوجيا القلب. إنّ تقانات الثدييات البالغة هي خلايا متمايزة بشكل نهائي ذات قدرة تكاثرية دنيا. لا تحد حالة ما بعد الميتكت من CMs الكبار من تقدم دورة خلايا القلب العضلي القلب فحسب، بل تحد أيضًا من ثقافة CMs الفعالة. وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للبالغين من أجل إجراء دراسات كثيرة، مثل انتشار الـ CM وتحليل التعبير الجيني.
الفأر والفئران هما الأكثر تفضيلا الحيوانات المختبرية لاستخدامها في عزل cardiomyocyte. وفي حين أن الثقافة الطويلة الأجل لـ CMs الفئران ممكنة، فإن الماوس البالغ عرضة للموت ولا يمكن استزراعه أكثر من خمسة أيام في ظل الظروف العادية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحسين عزل الخلية وبروتوكول الثقافة طويلة الأجل للبالغين مورين CMs. مع هذا البروتوكول المعدلة، فمن الممكن لعزل وثقافة كل من الماوس الكبار و CMs الفئران لأكثر من 20 يوما. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة نقل الـ(سيرنا) لـ CM المعزولة تزداد بشكل كبير مقارنة بالتقارير السابقة. لعزلة CM الماوس الكبار، يتم استخدام طريقة التحلل Langendorff مع حل انزيم الأمثل والوقت الكافي للتفكك المصفوفة خارج الخلية كاملة. من أجل الحصول على CMs البطين النقي ، تم تشريح كل من الأذينين والتخلص منه قبل الشروع في فصل وطلاء. وتفرقت الخلايا على لوحة مغلفة باللفين، مما سمح بتعلقها بكفاءة وسرعة. سُمح لـ CMs بتسوية 4-6 ساعات قبل نقل سيرنا. تم تحديث وسائل الإعلام الثقافة كل 24 ساعة لمدة 20 يوما، وبعد ذلك، تم إصلاح CMs وملطخة لعلامات القلب محددة مثل Troponin وعلامات دورة الخلية مثل KI67.

البروتوكول المعدل الحالي يسمح العزلة الفعالة وثقافة الفئران والفئران CMs في المختبر. لعزل الفئران CM، ما مجموعه 3 الكبار (12 أسبوعا) ذكر فيشر 344 الفئران استخدمت في هذا الإجراء. ويبين الشكل 1 الجهاز الجراحي والاجهزة العزلة المطلوبة في العملية؛ وقد تم وضع علامة على كل جزء ووصفها ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

هنا، نقدم بروتوكولاً للعزلة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان cardiomyocytes.

العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

الهدف من هذا الفيديو هو إظهار بروتوكول موحد لعزل القلب والقلب الكبار، والثقافة على المدى الطويل وtransfection. عزل واستزراع عضلة القلب من الفأر أو الفئران لا تزال وسيلة أساسية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا المستقلة من القلب والقلب داخل القلب السليم والمرض. هناك العديد من الأسئلة التي يمكننا الإجابة عليها باستخدام أمراض القلب المعزولة.مثل إمكانية الانتشار. هناك تغيرات في التعبير الجيني أو تعبيرات السيتوكين المحددة عند الاستجابة للإصابة. لسوء الحظ، لا البقاء على قيد الحياة القلب الماوس أسبوع واحد الماضية في ظروف الثقافة العادية.لذلك ، في هذا الفيديو ، نحن وصف طريقة محسنة لعزل الماوس الكبار cardiomyocytes ، محولة لهم وزرعها بعد 21 يوما ، وهذا الأسلوب هو في البداية من الصعب إتقانها. ولكن مع الممارسة يمكن للمرء أن يحقق حوالي 80 إلى 90٪ البقاء على قيد الحياة في cardiomyocytes بعد العزل وحوالي كفاءة 100 في المئة transfection. ومعظم هذه القلبية في الظروف الصحيحة يمكن البقاء على قيد الحياة في الماضي 20 يوما.تنظيف وتعقيم الأدوات الجراحية الخاصة بك عن طريق نقعها في 70٪ الكحول لمدة 15 دقيقة وغسلها في وقت لاحق مع الماء المقطر مزدوجة. بعد الماء، وترك الأدوات في الهواء لتجف المقبل، وتنظيف جهاز الافراز عن طريق تشغيل الكحول 70٪ مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. زيادة معدل التدفق سوف تساعد على تنظيف الأنابيب بعد الكحول شطف أي الكحول المتبقية عن طريق تشغيل الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقائق.إعداد ثلاثة أطباق لتنظيف القلب بعد الختان. ملء كل من الأطباق مع 20 ملليلتر من المخزن المؤقت myocyte. أضف إلى اثنين إلى ثلاث قطرات من الهيبارين إلى كل طبق مع ماصة باستور واخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.خذ حقنة 10 ملليلتر وملء مع المخزن المؤقت myocyte. إزالة أي من فقاعات الهواء من الحقنة ووضعه في الطبق الثالث في وضع الزاوية، وتأمينه مع الشريط. إعداد عقدة فضفاضة مع خياطة الجراحية ووضعها حول الإبرة.حقن الماوس مع الهيبارين من خلال حقن IP 20 دقيقة قبل التخدير. تعميم العازلة الزبيرة myocyte من خلال جهاز الافروزيون بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلترات في الدقيقة الواحدة. بعد خمس دقائق، استبدال العازلة مع وفرة انزيم، تشبع محلول انزيم مع الأكسجين أثناء العملية، مرة أخرى، تعيين محلول انزيم إلى معدل تدفق من ثلاثة mLs في الدقيقة الواحدة.تأكيد التخدير عن طريق معسر إصبع قدمه ووضع الماوس على منصة الجراحية. تعقيم الجلد مع 70٪ الكحول. فتح بعناية الصدر، وممارسة القلب ووضع القلب في الطبق الأول.اطهر الدم من القلب عن طريق الضغط اللطيف، ثم نقل القلب إلى الطبق الثاني لمزيد من تنظيف الدم من القلب وإزالة أي أنسجة غير قلبية. نقل القلب في وقت لاحق إلى الطبق الثالث. العثور على الشريان الأورطي واستخدام ملقط الخاص للحفاظ على بيتون أكثر وضعه حول إبرة التكيب.تأمين ذلك عن طريق سحب أسفل الخاص بك قبل تشديد عقدة ضيقة ومن ثم جعل عقدة ثانية. لثبات إضافي إصلاح النظام ومكان مع مساعدة من مقطع. تقليم أي خيط خياطة الزائدة، وأخيرا بدء إسراف القلب باستخدام المخزن المؤقت myocyte في الحقنة لمسح أي من الدم المتبقية في القلب.إزالة بعناية إبرة حساب من الحقنة وربطه إلى جهاز الافراة. محاولة لمنع أي فقاعات الهواء من الخوض في القلب. لأن هذا قد يؤثر على تدفق محلول الانزيم والهضم.نقل سترة الماء إلى أعلى، لتوفير بيئة متجانسة للقلب أثناء الوفرة. السماح لمحلول الإنزيم بالتدفق عبر القلب بسرعة 2-3 mLs في الدقيقة. دع محلول الإنزيم يتدفق عبر القلب لمدة دقيقتين.في دقيقتين، مزيج في 40 ميكرولترات من مائة ميكرومولار محلول كلوريد الكالسيوم لمحلول انزيم. السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لمدة 10 إلى 15 دقيقة أخرى. بمجرد أن يصبح التدفق سلسًا ويبدأ القلب في النظر إلى اللون البني والناعم ، فأنت تعرف أن لديك توزيعًا زوجيًا لأنزيم الكولاجين لتحقيق الهضم السليم للقلب.عندما تعتقد أن الهضم الخاص بك هو كامل، واتخاذ القلب إلى أسفل من نظام الغمر Langendorff ووضعها في طبق بيتري 16 ملليمتر مليئة خمسة ملليلتر من محلول انزيم وأخذه إلى قدم السلامة البيولوجية. إزالة بعناية الأذين والأنسجة الدهنية الزائدة. رمّز القلب في قطع محددة مع مساعدة من ملقط.خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها عند 45 درجة. استخدام ماصة باستور لكسر أنسجة القلب عن طريق الأنابيب لطيف صعودا وهبوطا. الهضم الأمثل يوفر تعليق من الخلايا القلبية واحدة بعد أن إضافة خمسة ملليلتر من وقف الحل لوقف نشاط انزيم لتجنب أكثر من الهضم، واتخاذ أول 50 ملليلتر أنبوب مخروطي ووضع مصفاة معقمة مائة ميكرون الخلية على ذلك.تمرير تعليق cardiomyocyte من خلال مصفاة الخلية لإزالة أي قطع كبيرة من الأنسجة. وأخيرا غسل المصفاة مع وقف الحل لجمع أي بقايا cardiomyocyte المرفقة. الطرد المركزي تعليق الخلية في 20 GS لمدة ثلاث دقائق والتخلص من الفائق.إعادة تعليق القلب و 10 ملليلتر من محلول التوقف، على فترات ثلاث دقائق في 10 ميكرولترات من 100 ملليمتر كلوريد كلوريد الكالسيوم حل أربع مرات ومزيج. بعد الطبعة الرابعة الطرد المركزي تعليق cardiomyocytes في 20 GS لمدة ثلاث دقائق والتخلص من supernatant. إعادة تعليق cardiomyocytes في وسائل الإعلام الثقافة قبل لوحة الخلايا في طبق 60 ملليمتر ووضعها في حاضنة CO2 لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.خلال ساعتين أو ثلاث ساعات سيتم الالتزام بأنواع الخلايا الملوثة الرئيسية مثل انفجارات الألياف لخدمة الطبق ، مما يسمح بالعزلة النقية لـ cardiomyocytes. بعد ذلك ، أخرج الطبق من الحاضنة وجمع عضلة القلب العائمة في أنبوب مخروطي وأعيد عضلة القلب في لامينين مغلف 24 طبقًا ثقافيًا جيدًا.أربع إلى ست ساعات كافية لـ cardiomyocytes للتمسك السطح. لذلك يمكن إجراء عملية نقل في ست ساعات بعد الطلاء. تم استخدام كاشف RNA IMAX transfection لزرع القلب مع siRNAs.وسائل الإعلام الثقافة يحتوي على 25 ميكرومولار الدم Staten تكملها 10٪ FBS، التي وجدنا أنها أكثر ملاءمة لأداء ثقافة cardiomyocyte على المدى الطويل والحث على تحليل الانتشار. بعد transfection، يمكنك عرض cardiomyocytes عن طريق المجهر باستخدام حاضنة صغيرة لكيفية الخلايا لتصوير الوقت الفاصل. هذه هي صور brightfield من قضيب عبر عدواة على شكل cardiomyocytes في التكبير منخفضة وعالية.هنا ، يمكنك أن ترى يوما بعد يوم التصوير ، والذي يعرض التغيرات في مورفولوجيا القلب الماوس الكبار. ونؤكد أن القلبية هي صحية وانكماشية في وقت مبكر من النقاط، وكذلك بعد التمايز D والثقافة على المدى الطويل. هنا مثال على تلطيخ مناعي Ki67 مما يدل على انتشار مستحث من أمراض القلب الكبار في الثقافة بعد siRNAs، وهو transfection.كما ترون من النتائج باستخدام هذه التقنية، يمكن للمرء الحصول على أمراض القلب الكبار صحية من الفأر والفئران والثقافة لهم لدراسة طويلة الأجل. في الختام، مرة واحدة يتقن هذه التقنية سوف تسمح لنا لدراسة cardiomyocytes بكثير وراء البروتوكولات زراعة الحالية.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

على المدى الطويل ثقافة الإنسان العينات والتحليل سرطان الثدي وذلك باستخدام التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...