Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Institut for Patologi og Laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et tilskud fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak er støttet af American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes af American Heart Association postdoc tilskud (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey støttes af et NIH T32-tilskud (HL 125204-06A1).

Alle forsøg bør udføres i overensstemmelse med retningslinjerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr offentliggjort af U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokoller, der vises i videoen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Forberedelse før hjerteekstraktion fra voksne mus (og rotter)
<ol><li>Forbered de tilsvarende perfusions-, enzym- og stopopløsninger i henhold til opskrifte...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Der er et kritisk behov for at etablere en protokol for voksne kardiomyocyt isolation og langsigtet kultur til at udføre celle-specifikke mekanistiske undersøgelser. Der er kun et par rapporter diskuterer voksne CM isolation protokoller, og endnu færre af dem bruges til langsigtet kultur af voksne mus CM15,16,17. Det er blevet påvist, at den voksne rotte CM har en højere tolerance over for in vitro kultur end de voksne mus ...

Hjertesygdomme er en af de førende dødsårsager på verdensplan. Næsten alle typer af hjerteskader resultere i et betydeligt tab af voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyr hjerter er ude af stand til at reparere deres hjerteskade på grund af senescent karakter af den voksne CM1. Således, enhver fornærmelse mod den voksne pattedyr hjerte resulterer i et permanent tab af CO'er, fører til nedsat hjertefunktion og hjertesvigt. I modsætning til voksne pattedyr, små dyr som zebrafisk og newt hjerter kan regenerere deres hjerteskade gennem eksisterende CM spredning2,3,4. En verdensomspændende indsats er i gang for at finde en ny terapeutisk intervention for hjerteskader via både proliferative og ikke-proliferative tilgange. I de seneste årtier, forskellige typer af genetiske musemodeller er blevet udviklet til at studere hjerteskader og reparation. Men ved hjælp af in vivo dyremodeller fortsætter med at være en dyr tilgang med den ekstra kompleksitet til at dechifrere en celle-autonome mekanisme fra sekundære virkninger. Udover, in vivo systemer er udfordrende at analysere CM specifikke virkninger af en farmakologisk intervention, der inducerer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMMs er nødvendig for at udføre CM spredning analyser. CM spredning assays kræver mindst 4-5 dage for celler, der skal induceres i celle cyklus og for at opnå nøjagtige data efter dette. Derudover, undersøgelser, der udnytter isolerede CMs for elektrofysiologiske undersøgelser, lægemiddelscreening, toksicitet undersøgelser, og Ca++ homøostase undersøgelser er alle behov for en forbedret kultur system5,,6,,7. Desuden viser nylige undersøgelser den kardiobeskyttende betydning af cytokiner udskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For at undersøge den terapeutiske rolle og molekylære mekanisme af disse kardiokiner under hjerte reparation og regenerering, en langvarig kultur er påkrævet.
Voksne rotter er robuste nok til isolation af encellede celler og langsigtet kultur i et in vitro-system10,11,12. Men voksne mus CMs er af stor interesse for in vitro assays, på grund af tilgængeligheden af en række genetisk modificerede musemodeller, som giver mulighed for design og udførelse af forskellige innovative analyser, der ikke er muligt med rotte CM13. I modsætning til voksne rotte CM isolation, er det ganske udfordrende at opnå en enkelt-celle suspension fra voksne mus hjerter, og den langsigtede kultur af voksne mus CMs i kulturen er endnu mere udfordrende.
Voksen CM isolation fra mus og rotte hjerter ved hjælp af en Langendorff system er tidligere blevet etableret for at studere CMfunktion 5,14,15. Her har vi beskrevet protokollerne for voksen CM isolering fra både rotter og mus, samt en modificeret langsigtet kultur, transfektion og CM spredning af isolerede celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Ex vivo kultur af voksne pattedyr kardiomyocytes (CMs) præsenterer den mest relevante eksperimentelle system for in vitro undersøgelse af hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differentierede celler med minimal spredningskapacitet. Den post-mitotiske tilstand af voksne CMs ikke kun begrænser cardiomyocyte celle cyklus progression, men også begrænser den effektive kultur AF CMs. Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMs er nødvendig for mange undersøgelser, såsom CM spredning og analyse af genekspression.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyr, der skal anvendes til kardiomyocyt isolation. Mens den langsigtede kultur af rotte CMs er muligt, voksne mus CMs er modtagelige for døden og kan ikke dyrkes mere end fem dage under normale forhold. Derfor er der et kritisk behov for at optimere celleisolering og langsigtet kultur protokol for voksne murine CMs. Med denne ændrede protokol er det muligt at isolere og kultur både voksne mus og rotte-CM'er i mere end 20 dage. Desuden er siRNA transfektionseffektiviteten af isoleret CM steget betydeligt sammenlignet med tidligere rapporter. Til isolering af voksenmus CM anvendes Langendorff perfusionsmetoden med en optimal enzymopløsning og tilstrækkelig tid til fuldstændig ekstracellulær matrixdissociation. For at opnå rene ventrikulære CMs, både atria blev dissekeret og kasseret, før du fortsætter med disassociation og plating. Celler blev spredt på en laminin belagt plade, som gav mulighed for effektiv og hurtig fastgørelse. CMs fik lov til at nøjes med 4-6 timer før siRNA transfektion. Kulturmedier blev opdateret hver 24 timer i 20 dage, og efterfølgende blev CMs repareret og plettet for hjertespecifikke markører som Troponin og markører for cellecyklus som KI67.

Den nuværende modificerede protokol giver mulighed for effektiv isolering og kultur af rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolation, i alt 3 voksne (12 uger gamle) mandlige Fischer 344 rotter blev anvendt i proceduren. Figur 1 viser det kirurgiske apparat og isoleringsopsætninger, der kræves i proceduren. hver del er markeret og beskrevet i figurlegenden. Kollagen type 2 blev brugt til fordøjelsen, hvilket giver en høj mængde af høj kvalitet CMs fra vellykket isolation (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Her præsenterer vi en protokol for isolation, transfektion, og langsigtet kultur af voksne mus og rotte kardiomyocytter.

Isolation, transfektion og langsigtet kultur af voksne mus og rat kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Formålet med denne video er at demonstrere en standardiseret protokol for voksne kardiomyocytter isolation, langsigtet kultur og transfektion. Isolering og dyrkning kardiomyocytter fra mus eller rotte fortsat være en væsentlig metode til at undersøge celle autonome biologi kardiomyocytter i den sunde og sygdom hjerte. Der er flere spørgsmål, vi kan besvare ved hjælp af isolerede kardiomyocytter.Såsom det proliferative potentiale. Der er genudtryksændringer eller specifikke cytokinudtryk ved skadesrespons. Desværre, mus kardiomyocytter ikke overleve sidste en uge i normal kultur betingelser.Derfor beskriver vi i denne video en optimeret metode til at isolere voksne mus kardiomyocytter, transfixed dem og dyrkede dem langt ud over 21 dage, denne teknik er i første omgang svært at mestre. Men med praksis kan man opnå omkring 80 til 90% overleve i cardiomyocytes efter isolation og omkring en 100 procent transfektion effektivitet. Og de fleste af disse kardiomyocytter i korrekte forhold kan overleve de sidste 20 dage.Rengør og steriliser dine kirurgiske instrumenter ved at iblødsætning dem i 70% alkohol i 15 minutter og efterfølgende vaske dem med dobbelt destilleret vand. Efter vandet skal værktøjet tørres næste gang, og fremspringet rengøres ved at køre 70 % alkohol to gange i fem minutter hver. Forøgelse af strømningshastigheden vil bidrage til at rense slangen efter alkohol skylle eventuelle resterende alkohol ved at køre dobbelt destilleret vand i 10 minutter.oprettet tre retter til at rense hjertet efter excision. Fyld hver af retterne med 20 milliliter myocyte buffer. Tilføj to til tre dråber heparin til hver skål med Pasteur pipette og bland Godt ved pipettering op og ned flere gange.Tag en 10 milliliter sprøjte og fyld den med myocyte buffer. Fjern luftboblerne fra sprøjten, og placer den i den tredje skål i vinklet position, der sikrer den med tape. Forbered en løs knude med kirurgisk sutur og læg den omkring nålen.Injicer musen med heparin gennem IP-injektion 20 minutter før anæstesi. Cirkulere myocyt-stødpude gennem eksfusionsapparatet med en strømningshastighed på tre milliliter pr. minut. Efter fem minutter erstattes den eksfusionsbuffer med enzymopløsning, enzymopløsningen mættes med ilt under processen, igen, indstille enzymopløsningen til en strømningshastighed på tre mLs pr. minut.Bekræft anæstesi ved tå klemme og placere musen på den kirurgiske platform. Steriliser huden med 70% alkohol. Åbn forsigtigt brystet, træn hjertet og læg hjertet i den første skål.Ryd blodet fra hjertet ved blid klemme, derefter overføre hjertet til den anden skål til yderligere at rense blodet fra hjertet og fjerne eventuelle ikke-hjertevæv. Derefter overføre hjertet til den tredje skål. Find aorta og bruge din krafterne til at holde det Peyton mere placere den omkring cannulating nål.Fastgør den ved at trække din pre stramme knude stramning og derefter gøre en anden knude. For yderligere stabilitet fastsætte rækkefølgen og sted ved hjælp af et klip. Trim overskydende sutur tråd, og endelig starte hjertet overflod ved hjælp af myocyt buffer i sprøjten for at rydde noget af blodet tilbage i hjertet.Fjern forsigtigt den beregnende kanyle fra sprøjten og krog den til det store apparat. Forsøg at forhindre eventuelle luftbobler i at gå ind i hjertet. Da dette kan påvirke strømmen af enzymopløsning og fordøjelse.Flyt vandjakken op for at give et homogent miljø til hjertet under overflod. Lad enzymopløsningen flyde gennem hjertet med en hastighed på to til tre mL i minuttet. Lad enzymopløsningen flyde gennem hjertet i to minutter.På to minutter blandes i 40 mikroliter af hundrede mikromolar calciumchloridopløsning til enzymopløsningen. Lad enzymopløsningen passere gennem hjertet i yderligere 10 til 15 minutter. Når strømmen bliver glat og hjertet begynder at se brun og blød, du ved, at du har en jævn fordeling af kollagenase enzym for at opnå en ordentlig fordøjelse af hjertet.Når du tror, din fordøjelse er færdig, tage hjertet ned fra Langendorff perfusion system og sætte det ind i en 16 millimeter petriskål fyldt med fem milliliter enzymopløsning og tage det til en biosikkerhed fod. Fjern omhyggeligt atria og ekstra fedtvæv. Hakke hjertet i definerede stykker ved hjælp af snævninger.Tag en steril Pasteur pipette og skær spidsen ved 45 grader. Brug Pasteur pipetten til at bryde hjertevævet op ved at give blide pipettering op og ned. Optimal fordøjelse giver en suspension af encellede kardiomyocytter efter at tilføje fem milliliter stopopløsning for at stoppe enzymaktiviteten for at undgå over fordøjelsen, Tag et første 50 milliliter konisk rør og placer en steril hundrede mikrocellestier på det.Pass kardiomyocyt suspension gennem cellen si at fjerne eventuelle store bidder af væv. Endelig vaskes sien med stopopløsning for at indsamle eventuelle påsatte kardiomyocyterester. Centrifuge cellen suspension ved 20 GS i tre minutter og kassér supernatant.Kardiomyocytterne og 10 milliliter stopopløsningen suspenderes igen med tre minutters mellemrum med 10 mikroliter 100 millimolar calciumchloridopløsning fire gange og blandes. Efter den fjerde udgave centrifuge kardiomyocytter suspension på 20 GS i tre minutter og kassér supernatant. Re suspendere kardiomyocytter i kulturmediet Pre plade cellerne i en 60 millimeter skål og sat i CO2 inkubator i to til tre timer.Om to til tre timer. De vigtigste forurenende celletyper som fiber blaster vil blive overholdt tjenesten af skålen, giver mulighed for ren isolering af kardiomyocytter. Derefter skal du tage skålen ud af inkubatoren og samle de flydende kardiomyocytter i et konisk rør og afspille kardiomyocytterne i en lamininbelagt 24 brøndkulturplade.Fire til seks timer er tilstrækkeligt til, at kardiomyocytterne kan holde sig til overfladen. Så transfektion kunne udføres på seks timer efter plating. RNA IMAX transinfektion reagens blev brugt til transplantation kardiomyocytter med siRNA.Kulturmediet indeholder 25 mikromolarblod Staten suppleret med 10% FBS, som vi har fundet er bedre egnet til at udføre langvarig kardiomyocyte kultur og fremkalde spredning analyse. Efter transfektion, kan du se kardiomyocytter ved mikroskopi udnytte en mikro inkubator til, hvordan er cellerne for time-lapse billeddannelse. Disse er brightfield billeder af transfected stang formet kardiomyocytter ved lav og høj forstørrelse.Her kan du se dag for dag billeddannelse, som viser ændringer i voksne mus kardiomyocyt morfologi. Vi bekræfter, at kardiomyocytterne er sunde og kontraktile på tidlige tidspunktpunkter, samt efter D-differentiering og langsigtet kultur. Her er et eksempel på Ki67 immunfluorescerende farvning demonstrere induceret spredning af voksne kardiomyocytter i kulturen efter siRNAs, en transfektion.Som du kan se fra resultaterne ved hjælp af denne teknik, kan man få sunde voksne kardiomyocytter fra mus og rotte og kultur dem for langsigtet undersøgelse. Afslutningsvis, når mestrer denne teknik vil give os mulighed for at studere kardiomyocytter langt ud over de nuværende dyrkning protokoller.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriel Berigelse af spermatogonstamceller Stem og progenitorceller (SSCs) i Kultur for Udledning af Langsigtede voksen mus SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolation, Kultur og funktionel karakterisering af Voksen Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering og Fysiologisk Analyse af Mouse cardiomyocytter

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering og dyrkning af Voksen Mouse kardiomyocytter for cellesignalering og<em&gt; In vitro</em&gt; Hjertehypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...