Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door financiering van het Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, College of Medicine, aan Dr. Onur Kanisicak; een subsidie van de National Institutes of Health (R01HL148598) aan Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wordt ondersteund door de American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam wordt ondersteund door de Postdoctorale subsidie van de American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey wordt ondersteund door een NIH T32-subsidie (HL 125204-06A1).

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door het Amerikaanse National Institute of Health (NIH). Alle protocollen weergegeven in de video werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati, College of Medicine.
1. Voorbereiding vóór hartextractie van volwassen muizen (en ratten)
<ol><li>Bereid de overeenkomstige perfusi...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Er is een kritische behoefte om een protocol voor volwassen cardiomyocyten isolatie en cultuur op lange termijn vast te stellen om celspecifieke mechanistische studies uit te voeren. Er zijn slechts een paar rapporten over volwassen CM isolatie protocollen, en nog minder van hen worden gebruikt voor de lange termijn cultuur van volwassen muizen CM15,16,17. Aangetoond wordt dat de volwassen rat CM een hogere tolerantie heeft voor...

Hartziekten zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Bijna alle vormen van hartletsel resulteren in een aanzienlijk verlies van volwassen cardiomyocyten (CMs). Volwassen zoogdier harten zijn niet in staat om hun hartletsel te herstellen als gevolg van de senescente aard van de volwassen CM1. Dus, elke belediging van de volwassen zoogdierhart resulteert in een permanent verlies van CMs, wat leidt tot verminderde hartfunctie en hartfalen. In tegenstelling tot volwassen zoogdieren kunnen kleine dieren zoals zebravissen en nieuwe harten hun hartletsel regenereren door bestaande CM proliferatie2,3,4. Een wereldwijde inspanning is aan de gang om een nieuwe therapeutische interventie voor hartletsel te vinden via zowel proliferative en niet-proliferative benaderingen. In de afgelopen decennia zijn verschillende soorten genetische muismodellen ontwikkeld om hartletsel en reparatie te bestuderen. Het gebruik van in vivo diermodellen blijft echter een dure benadering met de extra complexiteit om een celautonoom mechanisme te ontcijferen aan secundaire effecten. Bovendien zijn in vivo systemen een uitdaging om CM-specifieke effecten van een farmacologische interventie te analyseren die cardioprotectieve signalering van de CM induceert.
Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk om CM-proliferatieanalyses uit te voeren. CM proliferatie testen vereisen een minimum van 4-5 dagen voor cellen worden geïnduceerd in de celcyclus en om nauwkeurige gegevens te verkrijgen na dat. Bovendien, studies die gebruik maken van geïsoleerde CMs voor elektrofysiologische studies, drug screening, toxiciteit studies, en Ca++ homeostase studies zijn allemaal behoefte aan een verbeterde cultuur systeem5,6,7. Bovendien tonen recente studies de cardioprotectieve betekenis aan van cytokinen die zijn afgescheiden van CMs (cardiokines)8,9. Om de therapeutische rol en het moleculaire mechanisme van deze cardiokines tijdens hartreparatie en regeneratie te onderzoeken, is een langdurige cultuur vereist.
Volwassen rat-CMs zijn robuust genoeg voor eencellige isolatie en cultuur op lange termijn in een in vitrosysteem10,11,12. Echter, volwassen muis CMs zijn van groot belang voor in vitro testen, als gevolg van de beschikbaarheid van een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde muis modellen, die het mogelijk maakt voor het ontwerp en de uitvoering van verschillende innovatieve analyses die niet mogelijk zijn met rat CM13. In tegenstelling tot volwassen rat CM isolatie, is het heel uitdagend om een eencellige suspensie te verkrijgen van volwassen muis harten, en de lange termijn cultuur van volwassen muis CMs in de cultuur is nog uitdagender.
Volwassen CM isolatie van muis- en rattenharten met behulp van een Langendorff-systeem is eerder opgezet om CM-functie5,14,,15te bestuderen . Hier hebben we in detail de protocollen beschreven voor volwassen CM-isolatie van zowel ratten als muizen, evenals een gewijzigde langetermijncultuur, transfectie en CM-proliferatie van geïsoleerde cellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Ex vivo cultuur van de volwassen zoogdier cardiomyocyten (CMs) presenteert de meest relevante experimentele systeem voor de in vitro studie van cardiale biologie. Volwassen zoogdier-CMs zijn terminaal gedifferentieerde cellen met een minimale proliferative capaciteit. De post-mitotische toestand van volwassen CMs beperkt niet alleen cardiomyocyte celcyclusprogressie, maar beperkt ook de efficiënte cultuur van CMs. Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk voor veel studies, zoals CM-proliferatie en analyse van genexpressie.
De muis en de rat zijn de twee meest geprefereerde proefdieren die worden gebruikt voor cardiomyocyte isolatie. Hoewel de langetermijncultuur van ratten-OEM's mogelijk is, zijn volwassen muis-OEM's gevoelig voor de dood en kunnen ze niet langer dan vijf dagen onder normale omstandigheden worden gekweekt. Daarom is er een kritische behoefte om de celisolatie en het langetermijncultuurprotocol voor volwassen murine-OEM's te optimaliseren. Met dit gewijzigde protocol is het mogelijk om zowel volwassen muis- als ratten-OEM's gedurende meer dan 20 dagen succesvol te isoleren en te verlenen. Bovendien is de siRNA transfectie-efficiëntie van geïsoleerde CM aanzienlijk toegenomen in vergelijking met eerdere rapporten. Voor de CM-isolatie van de volwassen muis wordt de Langendorff-perfusiemethode gebruikt met een optimale enzymoplossing en voldoende tijd voor volledige extracellulaire matrixdissociatie. Om zuivere ventriculaire CMs te verkrijgen, werden beide atria ontleed en weggegooid alvorens verder te gaan met de dissociatie en beplating. Cellen werden verspreid op een laminine gecoate plaat, die het mogelijk gemaakt voor een efficiënte en snelle bevestiging. CMs mochten genoegen nemen met 4-6 uur voor siRNA transfectie. Cultuur media werd vernieuwd om de 24 uur voor 20 dagen, en vervolgens, CMs werden vastgesteld en gekleurd voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin en markers van celcyclus zoals KI67.

Het huidige gewijzigde protocol maakt efficiënte isolatie en cultuur van rat en muizen CMs in vitro mogelijk. Voor rat CM isolatie, een totaal van 3 volwassen (12 weken oude) mannelijke Fischer 344 ratten werden gebruikt in de procedure. Figuur 1 toont de chirurgische apparatuur en isolatieopstellingen die nodig zijn in de procedure; elk deel is gemarkeerd en beschreven in de figuurlegende. Collagenase type 2 werd gebruikt voor de spijsvertering, die een hoge hoeveelheid hoge kwaliteit CMs ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Het doel van deze video is om een gestandaardiseerd protocol aan te tonen voor volwassen cardiomyocyten isolatie, cultuur op lange termijn en transfectie. Het isoleren en culteren van cardiomyocyten van muis of rat blijft een essentiële methode om de cel autonome biologie van cardiomyocyten binnen het gezonde en ziektehart te onderzoeken. Er zijn verschillende vragen die we kunnen beantwoorden met behulp van geïsoleerde cardiomyocyten.Zoals het proliferative potentieel. Er zijn genexpressie veranderingen of specifieke cytokine uitdrukkingen bij letselrespons. Helaas, muis cardiomyocyten niet overleven afgelopen een week in normale cultuuromstandigheden.Daarom beschrijven we in deze video een geoptimaliseerde methode om cardiomyocyten van volwassen muizen te isoleren, ze te transfixeren en te kweekten tot ver na 21 dagen, deze techniek is in eerste instantie moeilijk onder de knie te krijgen. Maar met de praktijk kan men bereiken ongeveer 80 tot 90% overleven in cardiomyocyten na isolatie en ongeveer een 100 procent transfectie efficiëntie. En de meeste van deze cardiomyocyten in de juiste omstandigheden kunnen overleven afgelopen 20 dagen.Reinig en steriliseer uw chirurgische instrumenten door ze gedurende 15 minuten in 70% alcohol te weken en vervolgens te wassen met dubbel gedestilleerd water. Laat na het water het gereedschap in de lucht drogen, maak het overfusieapparaat schoon door elk twee keer 70% alcohol te drinken. Het verhogen van de stroomsnelheid zal helpen om de slang schoon te maken na alcohol uitspoelen van de resterende alcohol door het uitvoeren van dubbele gedestilleerd water gedurende 10 minuten.het opzetten van drie gerechten om het hart schoon te maken na excisie. Vul elk van de gerechten met 20 milliliter myocyte buffer. Voeg twee tot drie druppels heparine toe aan elke schotel met de Pasteur pipet en meng Well door meerdere keren op en neer te pipetten.Neem een spuit van 10 milliliter en vul deze met myocytenbuffer. Verwijder een van de luchtbellen uit de spuit en plaats deze in de derde schotel in een schuine positie en beveilig deze met tape. Bereid een losse knoop met chirurgische hechting voor en plaats deze rond de naald.Injecteer de muis met heparine via IP-injectie 20 minuten voor anesthesie. Circuleert de myocyte profusiebuffer door het overmaakapparaat met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut. Na vijf minuten, vervang de profusie buffer met enzymoplossing, verzadigen het enzym oplossing met zuurstof tijdens het proces, nogmaals, stel het enzym oplossing op een stroomsnelheid van drie mLs per minuut.Bevestig anesthesie door teen knijpen en plaats de muis op het chirurgische platform. Steriliseer de huid met 70% alcohol. Open voorzichtig de borst, oefen het hart uit en doe het hart in het eerste gerecht.Haal het bloed uit het hart door zachte knijpen, breng het hart dan naar de tweede schotel om het bloed verder schoon te maken uit het hart en om niet-cardiale weefsels te verwijderen. Breng vervolgens het hart over naar het derde gerecht. Zoek de aorta en gebruik je tangen om het Peyton meer te plaatsen rond de afzwingsnaald.Zet het vast door het trekken van uw pre strakke knoop aanscherping en vervolgens het maken van een tweede knoop. Voor extra stabiliteit fix de volgorde en plaats met behulp van een clip. Trim een overtollige hechting draad, en ten slotte start het hart overdaad met behulp van de myocyte buffer in de spuit om een van het bloed dat in het hart duidelijk.Verwijder de berekenende naald voorzichtig uit de spuit en haak deze vast aan het overfusieapparaat. Probeer te voorkomen dat luchtbellen in het hart gaan. Aangezien dit de stroom van de enzymoplossing en de spijsvertering kan beïnvloeden.Verplaats de waterjas omhoog, om een homogene omgeving te bieden aan het hart tijdens de overfusie. Laat de enzymoplossing door het hart stromen met een snelheid van twee tot drie mLs per minuut. Laat de enzymoplossing twee minuten door het hart stromen.Meng in twee minuten 40 microliter van honderd micromolar calciumchlorideoplossing aan de enzymoplossing. Laat de enzymoplossing nog 10 tot 15 minuten door het hart gaan. Zodra de stroom glad wordt en het hart begint te kijken bruin en zacht, je weet dat je een gelijkmatige verdeling van de collagenase enzym om een goede vertering van het hart te bereiken.Wanneer u denkt dat uw spijsvertering is voltooid, neem het hart uit de Langendorff perfusie systeem en zet het in een 16 millimeter petrischaal gevuld met vijf milliliter enzym oplossing en neem het mee naar een bioveiligheid voet. Verwijder de atria en extra vetweefsel voorzichtig. Hak het hart in bepaalde stukken met behulp van tangen.Neem een steriele Pasteur pipet en snijd de punt op 45 graden. Gebruik de Pasteur pipet om het hartweefsel te breken door zachte pipetting op en neer. Optimale spijsvertering biedt een suspensie van eencellige cardiomyocyten na dat voeg vijf milliliter stop-oplossing om de enzymactiviteit te stoppen om te voorkomen dat over de spijsvertering, Neem een eerste 50 milliliter conische buis en plaats een steriele honderd micron cel zeef op.Geef de cardiomyocyte suspensie door de celzeef om grote stukken weefsel te verwijderen. Tot slot was de zeef met stop oplossing om eventuele aangesloten cardiomyocyte resten te verzamelen. Centrifuge de cel suspensie op 20 GS gedurende drie minuten en gooi de supernatant.Stel de cardiomyocyten en 10 milliliter stopoplossing opnieuw op, met intervallen van drie minuten met 10 microliter van 100 millimolar calciumchlorideoplossing vier keer en meng. Na de vierde editie centrifuge de cardiomyocytes schorsing op 20 GS gedurende drie minuten en gooi de supernatant. Stel de cardiomyocyten opnieuw op in cultuurmedia Preplaat de cellen in een 60 millimeter schotel en zet twee tot drie uur in CO2-incubator.Over twee tot drie uur. De belangrijkste verontreiniging celtypes zoals vezel ontploffing zal worden nageleefd aan de dienst van het gerecht, waardoor voor pure isolatie van cardiomyocyten. Daarna, neem het gerecht uit de couveuse en het verzamelen van de drijvende cardiomyocyten in een conische buis en speelde de cardiomyocyten in een laminine gecoate 24 goed cultuur plaat.Vier tot zes uur is voldoende voor de cardiomyocyten om zich aan het oppervlak te hechten. Dus transfectie kan worden uitgevoerd op zes uur na beplating. RNA IMAX transfectie reagens werd gebruikt om cardiomyocyten te transplanteren met siRNAs.De kweekmedia bevat 25 micromolarbloed Staten aangevuld met 10%FBS, waarvan we hebben vastgesteld dat het beter geschikt is om de cardiomyocytencultuur op lange termijn uit te voeren en proliferatieanalyse op te wekken. Na transfectie u de cardiomyocyten bekijken door microscopie met behulp van een micro-incubator om te zien hoe de cellen voor time-lapse beeldvorming. Dit zijn brightfield beelden van transfected staaf vormige cardiomyocyten bij lage en hoge vergroting.Hier u van dag tot dag beeldvorming zien, die veranderingen in de cardiomyocyte morfologie van volwassen muizen laat zien. We bevestigen dat de cardiomyocyten gezond en contractiel zijn op vroege tijdstippen, evenals na D-differentiatie en cultuur op lange termijn. Hier is een voorbeeld van Ki67 immunofluorescente kleuring waaruit blijkt geïnduceerde proliferatie van volwassen cardiomyocyten in de cultuur na siRNAs, een transfectie.Zoals u zien aan de resultaten met behulp van deze techniek, kan men verkrijgen gezonde volwassen cardiomyocyten van muis en rat en cultuur hen voor lange termijn studie. Tot slot, eenmaal onder de knie deze techniek zal ons toelaten om cardiomyocyten te bestuderen ver buiten de huidige culturing protocollen.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...