Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Ce travail a été appuyé par le financement du Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de Cincinnati, College of Medicine, au Dr Onur Kanisicak; une subvention des National Institutes of Health (R01HL148598) au Dr Onur Kanisicak. Le Dr Onur Kanisicak est soutenu par l’American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Le Dr Perwez Alam est soutenu par la subvention postdoctorale de l’American Heart Association (AHA_20POST35200267). Le Dr Malina J. Ivey est soutenu par une subvention T32 des NIH (HL 125204-06A1).

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément aux lignes directrices du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le National Institute of Health (NIH) des États-Unis. Tous les protocoles affichés dans la vidéo ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Cincinnati, College of Medicine.
1. Préparation avant l’extraction cardiaque de souris adultes (et rats)
<ol><li>Prépare...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Il est essentiel d’établir un protocole pour l’isolement cardiomyocyte adulte et la culture à long terme pour effectuer des études mécanistes spécifiques aux cellules. Il n’y a que quelques rapports discutant des protocoles adultes d’isolement cm, et encore moins d’entre eux sont utilisés pour la culture à long terme des souris adultes CM15,16,17. Il est démontré que le rat adulte CM a une plus grande toléran...

Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes de décès dans le monde. Presque tous les types de lésions cardiaques entraînent une perte importante de cardiomyocytes adultes (CM). Les cœurs de mammifères adultes sont incapables de réparer leurs lésions cardiaques en raison de la nature sénescente du CM1adulte. Ainsi, toute insulte au cœur des mammifères adultes entraîne une perte permanente de CMs, conduisant à une diminution de la fonction cardiaque et l’insuffisance cardiaque. Contrairement aux mammifères adultes, les petits animaux comme le poisson zèbre et les cœurs de newt peuvent régénérer leurs lésions cardiaques par la prolifération existante cm2,3,4. Un effort mondial est en cours pour trouver une nouvelle intervention thérapeutique pour les lésions cardiaques par le biais d’approches prolifératives et non prolifératives. Au cours des dernières décennies, divers types de modèles génétiques de souris ont été développés pour étudier les lésions cardiaques et la réparation. Cependant, l’utilisation de modèles animaux in vivo continue d’être une approche coûteuse avec la complexité supplémentaire pour déchiffrer un mécanisme cellulaire autonome à partir d’effets secondaires. En outre, les systèmes in vivo sont difficiles à analyser les effets spécifiques cm d’une intervention pharmacologique qui induit la signalisation cardioprotectrice de la CM.
De plus, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour effectuer des analyses de prolifération des CM. Les tests de prolifération cm nécessitent un minimum de 4-5 jours pour que les cellules soient induites dans le cycle cellulaire et pour obtenir des données précises par la suite. En outre, les études qui utilisent des CM isolés pour des études électrophysiologiques, le dépistage des médicaments, les études de toxicité, et les études d’homéostasie Ca++ ont tous besoin d’un système de culture amélioré5,6,7. En outre, des études récentes montrent l’importance cardioprotectrice des cytokines sécrétées par les CMs (cardiokines)8,9. Afin d’étudier le rôle thérapeutique et le mécanisme moléculaire de ces cardiokines pendant la réparation et la régénération de coeur, une culture prolongée est exigée.
Les CMs adultes de rat sont assez robustes pour l’isolement unicellulaire et la culture à long terme dans un système in vitro10,11,12. Cependant, les CM de souris adultes sont d’un grand intérêt pour les tests in vitro, en raison de la disponibilité d’une variété de modèles de souris génétiquement modifiés, ce qui permet la conception et l’exécution de diverses analyses innovantes qui ne sont pas possibles avec le rat CM13. Contrairement à l’isolement adulte de CM de rat, il est assez difficile d’obtenir une suspension d’une seule cellule des coeurs de souris adultes, et la culture à long terme des CM de souris adultes dans la culture est encore plus difficile.
L’isolement adulte de CM des coeurs de souris et de rat utilisant un système de Langendorff a précédemment été établi pour étudier la fonction de CM5,14,15. Ici, nous avons décrit en détail les protocoles pour l’isolement adulte de CM des rats et des souris, aussi bien qu’une culture modifiée à long terme, la transfection, et la prolifération de CM des cellules isolées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

La culture ex vivo des cardiomyocytes mammifères adultes (CM) présente le système expérimental le plus pertinent pour l’étude in vitro de la biologie cardiaque. Les CMs des mammifères adultes sont des cellules différenciées en phase terminale avec une capacité proliférative minimale. L’état post-mitotique des MCM adultes non seulement limite la progression du cycle cellulaire cardiomyocyte, mais limite également la culture efficace des CM. En outre, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour de nombreuses études, telles que la prolifération cm et l’analyse de l’expression des gènes.
La souris et le rat sont les deux animaux de laboratoire les plus préférés à être utilisés pour l’isolement cardiomyocyte. Bien que la culture à long terme des CMs de rat soit possible, les CMs adultes de souris sont sensibles à la mort et ne peuvent pas être cultivés plus de cinq jours dans des conditions normales. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser l’isolement cellulaire et le protocole de culture à long terme pour les CM murines adultes. Avec ce protocole modifié, il est possible d’isoler et de culture avec succès les CM adultes de souris et de rats pendant plus de 20 jours. De plus, l’efficacité de la transfection du SIRNA du CM isolé est considérablement augmentée par rapport aux rapports précédents. Pour l’isolement cm de souris adulte, la méthode de perfusion de Langendorff est employée avec une solution enzymatique optimale et le temps suffisant pour la dissociation complète de matrice extracellulaire. Afin d’obtenir des MC ventriculaires purs, les deux atrias ont été disséqués et jetés avant de procéder à la dissociation et au placage. Les cellules ont été dispersées sur une plaque enduite de laminine, ce qui a permis un attachement efficace et rapide. Les CM ont été autorisés à se contenter de 4-6 h avant la transfection de siRNA. Les médias culturels ont été rafraîchis tous les 24 h pendant 20 jours, et par la suite, les CM ont été fixés et tachés pour des marqueurs cardiaques spécifiques tels que la troponine et des marqueurs du cycle cellulaire tels que KI67.

Le protocole modifié actuel permet l’isolement efficace et la culture des rats et des souris CMs in vitro. Pour l’isolement de CM de rat, un total de 3 adultes (12 semaines)mâle Fischer 344 rats ont été utilisés dans la procédure. La figure 1 montre l’appareil chirurgical et les configurations d’isolement requises dans la procédure; chaque partie a été marquée et décrite dans la légende de la figure. Collagène de type 2 a été utilisé pour la digestion, ce qui donne un...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

L’objectif de cette vidéo est de démontrer un protocole normalisé pour l’isolement des cardiomyocytes adultes, la culture à long terme et la transfection. Isoler et cultiver les cardiomyocytes de souris ou de rats continue d’être une méthode essentielle pour étudier la biologie cellulaire autonome des cardiomyocytes dans le cœur sain et de la maladie. Il y a plusieurs questions auxquelles nous pouvons répondre à l’aide de cardiomyocytes isolés.Comme le potentiel proliférant. Il y a des changements d’expression de gène ou des expressions spécifiques de cytokine sur la réponse de blessure. Malheureusement, les cardiomyocytes de souris ne survivent pas au-delà d’une semaine dans des conditions normales de culture.Par conséquent, dans cette vidéo, nous décrivons une méthode optimisée pour isoler les cardiomyocytes adultes de souris, les transfixés et les avons cultivés bien au-delà de 21 jours, cette technique est d’abord difficile à maîtriser. Mais avec la pratique, on peut atteindre environ 80 à 90% survivre dans les cardiomyocytes après l’isolement et environ une efficacité de transfection à 100 pour cent. Et la plupart de ces cardiomyocytes dans des conditions correctes peuvent survivre au-delà de 20 jours.Nettoyez et stérilisez vos instruments chirurgicaux en les trempant dans 70% d’alcool pendant 15 minutes et en les lavant par la suite avec de l’eau distillée double. Après l’eau, laisser sécher les outils dans l’air, nettoyer l’appareil de profusion en courant 70% d’alcool deux fois pendant cinq minutes chacun. L’augmentation du débit aidera à nettoyer le tube après que l’alcool rince tout alcool restant en faisant couler l’eau distillée double pendant 10 minutes.mettre en place trois plats pour nettoyer le cœur après l’excision. Remplissez chacun des plats avec 20 millilitres de tampon de myocyte. Ajouter deux à trois gouttes d’héparine à chaque plat avec la pipette Pasteur et bien mélanger en pipetting de haut en bas plusieurs fois.Prenez une seringue de 10 millilitres et remplissez-la d’un tampon de myocyte. Retirez l’une des bulles d’air de la seringue et placez-la dans le troisième plat en position inclinée, en la sécurisant avec du ruban adhésif. Préparer un nœud lâche avec suture chirurgicale et le placer autour de l’aiguille.Injecter de l’héparine à la souris par injection IP 20 minutes avant l’anesthésie. Faites circuler le tampon de profusion de myocyte par l’appareil de profusion à une vitesse d’écoulement de trois millilitres par minute. Après cinq minutes, remplacer le tampon de profusion par une solution enzymatique, saturer la solution enzymatique avec de l’oxygène pendant le processus, encore une fois, définir la solution enzymatique à un débit de trois mLs par minute.Confirmez l’anesthésie par pincement des pieds et placez la souris sur la plate-forme chirurgicale. Stériliser la peau avec 70% d’alcool. Ouvrez soigneusement la poitrine, exercez le cœur et mettez le cœur dans le premier plat.Effacer le sang du cœur en serrant doucement, puis transférer le cœur dans le deuxième plat pour nettoyer davantage le sang du cœur et enlever les tissus non cardiaques. Transférer ensuite le cœur dans le troisième plat. Trouvez l’aorte et utilisez vos forceps pour le garder Peyton plus le placer autour de l’aiguille de cannulating.Fixez-le en tirant vers le bas votre serrage pré serré noeud, puis faire un deuxième noeud. Pour plus de stabilité fixer l’ordre et le lieu à l’aide d’un clip. Coupez tout fil de suture excédentaire, et enfin commencer la profusion cardiaque en utilisant le tampon myocyte dans la seringue pour effacer tout le sang restant dans le cœur.Retirez soigneusement l’aiguille de calcul de la seringue et accrochez-la à l’appareil de profusion. Essayez d’empêcher les bulles d’air d’entrer dans le cœur. Comme cela peut affecter le flux de la solution enzymatique et la digestion.Déplacez la veste d’eau vers le haut, pour fournir un environnement homogène au coeur pendant la profusion. Laissez la solution enzymatique circuler à travers le cœur avec une vitesse de deux à trois mLs par minute. Laissez la solution enzymatique couler à travers le cœur pendant deux minutes.À deux minutes, mélanger dans 40 microlitres d’une centaine de micromolaire solution de chlorure de calcium à la solution enzymatique. Laissez passer la solution enzymatique dans le cœur pendant encore 10 à 15 minutes. Une fois que le flux devient lisse et le cœur commence à regarder brun et doux, vous savez que vous avez une distribution égale de l’enzyme collagène pour atteindre une bonne digestion du cœur.Lorsque vous pensez que votre digestion est terminée, prenez le cœur vers le bas du système de perfusion Langendorff et le mettre dans une boîte de 16 millimètres Petri rempli de cinq millilitres de solution enzymatique et l’emmener à un pied de biosécurité. Retirer délicatement les atrions et les tissus adipeux supplémentaires. Hacher le cœur en morceaux définis à l’aide de forceps.Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à 45 degrés. Utilisez la pipette Pasteur pour briser le tissu cardiaque en faisant de doux tuyaux de haut en bas. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires après cela ajouter cinq millilitres de solution d’arrêt pour arrêter l’activité enzymatique pour éviter la sur digestion, Prendre un premier tube conique de 50 millilitres et placer une passoire stérile de cellules d’une centaine de microns sur elle.Passez la suspension cardiomyocyte à travers la passoire cellulaire pour enlever tous les gros morceaux de tissu. Enfin laver la passoire avec la solution d’arrêt pour recueillir tous les restes de cardiomyocyte attachés. Centrifuger la suspension cellulaire à 20 GS pendant trois minutes et jeter le supernatant.Suspendre à nouveau les cardiomyocytes et 10 millilitres de solution d’arrêt, à intervalles de trois minutes à 10 microlitres de solution de chlorure de calcium de 100 millimaux quatre fois et mélanger. Après la centrifugeuse quatrième édition, les cardiomyocytes nt suspendus à 20 GS pendant trois minutes et jettent le supernatant. Suspendre à nouveau les cardiomyocytes dans les supports de culture Pré plaquer les cellules dans un plat de 60 millimètres et mettre dans l’incubateur de CO2 pendant deux à trois heures.Dans deux à trois heures. Les principaux types de cellules contaminantes comme les explosions de fibres seront respectés au service du plat, permettant un isolement pur des cardiomyocytes. Après cela, sortez le plat de l’incubateur et recueillez les cardiomyocytes flottants dans un tube conique et rejouez les cardiomyocytes dans une plaque de culture de 24 puits recouverte de laminine.Quatre à six heures suffisent pour que les cardiomyocytes adhèrent à la surface. Ainsi, la transfection pourrait être effectuée à six heures après le placage. Le réaccent de transfection IMAX d’ARN a été employé pour transplanter des cardiomyocytes avec des siRNAs.Le média de culture contient 25 micromolaires de sang Staten complété par 10%FBS, que nous avons trouvé est mieux adapté pour effectuer la culture cardiomyocyte à long terme et induire l’analyse de prolifération. Après la transfection, vous pouvez visualiser les cardiomyocytes par microscopie à l’aide d’un micro-incubateur pour savoir comment sont les cellules pour l’imagerie en accéléré. Ce sont des images brillantes de cardiomyocytes transfectés en forme de tige à grossissement faible et élevé.Ici, vous pouvez voir l’imagerie de jour en jour, qui met en valeur les changements dans la morphologie cardiomyocyte souris adulte. Nous confirmons que les cardiomyocytes sont sains et contractiles aux points tôt de temps, aussi bien qu’après la différenciation de D et la culture à long terme. Voici un exemple de coloration immunofluorescente Ki67 démontrant la prolifération induite des cardiomyocytes adultes dans la culture après siARN, une transfection.Comme vous pouvez le voir sur les résultats en utilisant cette technique, on peut obtenir des cardiomyocytes adultes en bonne santé de la souris et le rat et les culture pour l’étude à long terme. En conclusion, une fois maîtrisée, cette technique nous permettra d’étudier les cardiomyocytes bien au-delà des protocoles de culture actuels.

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