Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמחלקה לפתולוגיה ורפואה במעבדה, אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה, לד"ר אונור קניסיסק; מענק מהכונים הלאומיים לבריאות (R01HL148598) לד"ר אונור קניסיקאק. ד"ר אונור קניסיקק נתמך על ידי פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי (18CDA34110117). ד"ר Perwez עלאם נתמך על ידי מענק פוסט-ת"ר של איגוד הלב האמריקאי (AHA_20POST35200267). ד"ר מלינה J. Ivey נתמך על ידי מענק NIH T32 (HL 125204-06A1).

כל הניסויים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). כל הפרוטוקולים המוצגים בסרטון אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה.
1. הכנה לפני חילוץ לב מעכ...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

יש צורך קריטי להקים פרוטוקול לבידוד cardiomyocyte למבוגרים ותרבות לטווח ארוך כדי לבצע מחקרים מכניים ספציפיים לתא. יש רק כמה דיווחים דנים פרוטוקולי בידוד CM למבוגרים, ואפילו פחות מהם משמשים לתרבות ארוכת טווח של עכברים בוגרים CM15,16,17. זה הראו כי CM ח?...

מחלות לב הן אחת הסיבות המובילות למוות ברחבי העולם. כמעט כל סוגי פגיעת לב לגרום לאובדן משמעותי של cardiomyocytes למבוגרים (CMs). לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים לתקן את פציעת הלב שלהם בשל אופיו הרגיש של CM1 הבוגר. לכן, כל עלבון ללב היונקים הבוגרים גורם לאובדן קבוע של CMs, המוביל לתפקוד לב מופחת ואי ספיקת לב. שלא כמו יונקים בוגרים, בעלי חיים קטנים כמו דגי זברה ולבבות ניוט יכולים לחדש את פגיעת הלב שלהםבאמצעות התפשטותCM קיימת 2,3,4. מאמץ עולמי הוא מתמשך למצוא התערבות טיפולית חדשנית עבור פגיעה לב באמצעות גישות הן proliferative ולא התפשטות. בעשורים האחרונים פותחו סוגים שונים של מודלים של עכברים גנטיים כדי ללמוד פגיעה ותיקון לב. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים vivo ממשיך להיות גישה יקרה עם המורכבות הנוספת כדי לפענח מנגנון תא אוטונומי מאפקטים משניים. חוץ מזה, במערכות vivo מאתגרים לנתח CM השפעות ספציפיות של התערבות תרופתית הגורם איתות cardioprotective מן CM.
יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים יש צורך לבצע ניתוחי התפשטות CM. CM התפשטות assays דורשים מינימום של 4-5 ימים עבור תאים להיות מושרה לתוך מחזור התא ולקבל נתונים מדויקים לאחר מכן. בנוסף, מחקרים המשתמשים CMs מבודדים עבור מחקרים אלקטרופיזיולוגיים, סינון סמים, מחקרי רעילות, ו Ca++ מחקרי הומסטאזיס כולם זקוקים למערכת תרבות משופרת5,6,7. יתר על כן, מחקרים אחרונים מראים את המשמעות cardioprotective של ציטוקינות הפרשת CMs (cardiokines)8,,9. על מנת לחקור את התפקיד הטיפולי ואת המנגנון המולקולרי של קרדיוקין אלה במהלך תיקון לב והתחדשות, נדרשת תרבות ממושכת.
מלשינים של חולדות בוגרות חזקים מספיק לבידוד חד-תאי ולתרבות ארוכת טווחבמערכת חוץ-חוץ-10,,11,,12. עם זאת, CMs עכבר מבוגר הם עניין רב עבור חוץ חוץ, בשל הזמינות של מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטית, המאפשר עיצוב וביצוע של ניתוחים חדשניים שונים שאינם אפשריים עם חולדה CM13. בניגוד לבידוד CM חולדה למבוגרים, זה די מאתגר לקבל השעיה חד-תאית מלבבות עכבר מבוגר, ואת התרבות לטווח ארוך של CMs עכבר מבוגר בתרבות הוא אפילו יותר מאתגר.
בידוד CM למבוגרים מלבבות עכבר וחולדות באמצעות מערכת Langendorff הוקמה בעבר כדי ללמוד CMפונקציה 5,14,15. כאן, תיארנו בפירוט את הפרוטוקולים לבידוד CM למבוגרים הן חולדות ועכברים, כמו גם תרבות ארוכת טווח שונה, transfection, והתפשטות CM של תאים מבודדים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

תרבות החיים לשעבר של קרדיומיוציטים יונקים בוגרים (CMs) מציגה את המערכת הניסיונית הרלוונטית ביותר למחקר במבחנה של ביולוגיה לבבית. CMs יונקים בוגרים הם תאים מובדילים סופנית עם קיבולת התפשטות מינימלית. המצב שלאחר המיטוטיקה של CMs למבוגרים לא רק מגביל את התקדמות מחזור תא cardiomyocyte, אלא גם מגביל את התרבות היעילה של CMs. יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים היא הכרחית עבור מחקרים רבים, כגון התפשטות CM וניתוח של ביטוי גנים.
העכבר והעכברוש הם שתי חיות המעבדה המועדפות ביותר שישמשו לבידוד קרדיומיוציט. בעוד התרבות ארוכת הטווח של CMs חולדה אפשרית, CMs עכבר מבוגר רגישים למוות ולא ניתן לתרע יותר מחמישה ימים בתנאים נורמליים. לכן, יש צורך קריטי לייעל את בידוד התא ואת פרוטוקול תרבות לטווח ארוך עבור CMs murine למבוגרים. עם פרוטוקול זה שונה, ניתן לבודד בהצלחה ותרבות הן עכבר בוגר ועכברוש CMs במשך יותר מ 20 ימים. יתר על כן, יעילות הטרנס-תום-רוחב של סי.אם מבודד גדלה באופן משמעותי בהשוואה לדוחות קודמים. עבור בידוד CM עכבר מבוגר, שיטת perfusion Langendorff מנוצל עם פתרון אנזים אופטימלי ומספיק זמן עבור דיסוציאציה מטריצה extracellular מלא. על מנת להשיג CMs חדרי טהור, שני atria נותקו והושלכו לפני שהמשיך עם ההתנתקות והציפוי. התאים פוזרו על צלחת מצופה למימינין, מה שאפשר חיבור יעיל ומהיר. CMs הורשו להסתפק 4-6 שעות לפני תירגם siRNA. מדיה תרבות היה רענן כל 24 שעות במשך 20 ימים, ולאחר מכן, CMs היו קבועים ומוכתמים עבור סמנים ספציפיים לב כגון טרופונין סמנים של מחזור תא כגון KI67.

הפרוטוקול הנוכחי שונה מאפשר בידוד יעיל ותרבות של חולדות ועכברים CMs במבחנה. עבור חולדה CM בידוד, בסך הכל 3 מבוגר (12 שבועות) זכר פישר 344 חולדות שימשו בהליך. איור 1 מציג את הגדרות הציוד הכירורגי והבידוד הנדרשות בהליך; כל חלק סומן ותואר במקרא הדמות. קולגנס סוג 2 שימש לעיכול, אשר מניב ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

מטרת הסרטון הזה היא להדגים פרוטוקול סטנדרטי לבידוד קרדיומיוציטים למבוגרים, תרבות ארוכת טווח ו transfection. בידוד ו culturing cardiomyocytes מעכבר או חולדה ממשיכים להיות שיטה חיונית כדי לחקור את הביולוגיה האוטונומית התא של קרדיומיוציטים בתוך הלב בריא ומחלות. יש כמה שאלות שאנחנו יכולים לענות באמצעות קרדיומיוציטים מבודדים.כמו הפוטנציאל המשגשג. ישנם שינויים בביטוי גנים או ביטויי ציטוקין ספציפיים עם תגובת הפציעה. למרבה הצער, קרדיומיוציטים עכבר לא לשרוד בשבוע אחד בתנאי תרבות נורמלית.לכן, בסרטון זה, אנו מתארים שיטה ממוטבת לבודד קרדיומיוציטים עכבר בוגר, transfixed אותם ותרבת אותם הרבה מעבר 21 ימים, טכניקה זו קשה בתחילה לשלוט. אבל עם תרגול אפשר להשיג כ 80 עד 90% לשרוד קרדיומיוציטים לאחר בידוד על 100 אחוז יעילות transfection. ורוב הקרדיומיוציטים האלה בתנאים הנכונים יכולים לשרוד את 20 הימים האחרונים.נקו וערקו את המכשירים הכירורגיים שלכם על ידי השרייתם ב-70% אלכוהול למשך 15 דקות ולאחר מכן שטפו אותם במים מזוקקים כפולים. לאחר המים, להשאיר את הכלים באוויר להתייבש הבא, לנקות את המנגנון שפע על ידי הפעלת 70% אלכוהול פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. הגדלת קצב הזרימה תסייע לנקות את הצינורות לאחר אלכוהול לשטוף את כל האלכוהול שנותר על ידי הפעלת מים מזוקקים כפול במשך 10 דקות.הגדר שלוש מנות כדי לנקות את הלב לאחר כריתה. ממלאים כל אחת מהמנות ב-20 מיליליטר של חיץ מיוציט. מוסיפים שתיים עד שלוש טיפות של הפרין לכל מנה עם פיפטה פסטר ומערבבים היטב על ידי צינורות למעלה ולמטה מספר פעמים.קח מזרק 10 מיליליטר ולמלא אותו עם חיץ מיוציט. מוציאים את כל בועות האוויר מהמזרק וממקמים אותו בצלחת השלישית בתצב זוויתי, ומאבטחים אותו בקלטת. הכינו קשר רופף עם תפר כירורגי וה מניחים אותו סביב המחט.להזריק את העכבר עם הפרין באמצעות הזרקת IP 20 דקות לפני הרדמה. הפיץ את חיץ שפע מיוציט דרך מנגנון שפע בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה. לאחר חמש דקות, להחליף את חיץ שפע עם פתרון אנזים, להרוות את פתרון האנזים עם חמצן במהלך התהליך, שוב, להגדיר את פתרון האנזים לקצב זרימה של שלושה mLs לדקה.אשר הרדמה על ידי צביטת בוהן והנח את העכבר על הפלטפורמה הכירורגית. לחיטוי העור עם 70% אלכוהול. בזהירות לפתוח את החזה, לממש את הלב ולשים את הלב בצלחת הראשונה.לנקות את הדם מהלב על ידי סחיטה עדינה, ולאחר מכן להעביר את הלב לצלחת השנייה כדי לנקות עוד יותר את הדם מהלב כדי להסיר את כל הרקמות שאינן לב. לאחר מכן להעביר את הלב לצלחת השלישית. מצא את אבי הישבן ולהשתמש מטלטולים שלך כדי לשמור אותו פייטון יותר הצבת אותו סביב מחט cannulating.לאבטח אותו על ידי משיכת למטה הידוק הקשר ההדוק מראש שלך ולאחר מכן ביצוע קשר שני. ליציבות נוספת, תקן את הסדר והמקום בעזרת קליפ. לקצץ כל חוט תפר עודף, ולבסוף להתחיל את שפע הלב באמצעות חיץ מיוציט במזרק כדי לנקות את כל הדם שנותר בלב.בזהירות להסיר את המחט חישוב מן המזרק ולחבר אותו למנגנוני שפע. נסה למנוע מבועות אוויר להיכנס ללב. כמו זה עשוי להשפיע על זרימת פתרון האנזים ועיכול.להזיז את ז'קט המים למעלה, כדי לספק סביבה הומוגנית ללב במהלך שפע. אפשר לפתרון האנזים לזרום דרך הלב במהירות של שניים עד שלושה MLs לדקה. תן לתסימת האנזים לזרום דרך הלב במשך שתי דקות.בשתי דקות, מערבבים 40 מיקרוליטרים של פתרון סידן כלורי מיקרומולארי לפתרון האנזים. תן פתרון האנזים לעבור דרך הלב עוד 10 עד 15 דקות. ברגע שהזרימה הופכת חלקה והלב מתחיל להיראות חום ורך, אתה יודע שיש לך הפצה שווה של אנזים הקולגנס כדי להשיג עיכול נכון של הלב.כאשר אתה חושב העיכול שלך הושלם, לקחת את הלב למטה מן מערכת זלוף Langendorff ולשים אותו לתוך צלחת פטרי 16 מילימטר מלא חמישה מיליליטר של פתרון אנזים ולקחת אותו לרגל biosafety. בזהירות להסיר את הרקמה אטריה ושומן נוסף. טחון את הלב בחלקים מוגדרים בעזרת מדפים.קח פיפטה פסטר סטרילי לחתוך את הקצה שלה ב 45 מעלות. השתמש פיפטה פסטר כדי לשבור את רקמת הלב על ידי צינורות עדינים למעלה ולמטה. עיכול אופטימלי מספק השעיה של cardiomyocytes תא יחיד לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון להפסיק לעצור את פעילות האנזים כדי למנוע עיכול יתר, לקחת צינור חרוט 50 מיליליטר הראשון ולה מניחים מסננת תאים סטרילי מאה מיקרון על זה.להעביר את ההשעיה cardiomyocyte דרך מסננת התא כדי להסיר את כל גושים גדולים של רקמה. לבסוף לשטוף את מסננת עם פתרון להפסיק לאסוף את כל שרידי cardiomyocyte המצורפת. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 20 GS במשך שלוש דקות ולהשליך את supernatant.להשעות מחדש את cardiomyocytes ו 10 מיליליטר של פתרון להפסיק, במרווחים של שלוש דקות ב 10 microliters של 100 מילימולר סידן כלורי פתרון ארבע פעמים ומערבבים. לאחר המהדורה הרביעית צנטריפוגה ההשעיה cardiomyocytes ב 20 GS במשך שלוש דקות ולהשליך את supernatant. להשעות מחדש את cardiomyocytes לתוך מדיה תרבות Pre צלחת התאים לתוך צלחת 60 מילימטר והכניס אינקובטור CO2 במשך שעתיים עד שלוש שעות.בעוד שעתיים-שלוש. סוגי התאים מזהמים העיקריים כמו תקיעות סיבים יהיה דבק בשירות של המנה, המאפשר בידוד טהור של cardiomyocytes. לאחר מכן, להוציא את המנה מהאינקובטור ולאסוף את cardiomyocytes צף בצינור חרוט מחדש את cardiomyocytes בצלחת תרבות למינין מצופה 24 היטב.ארבע עד שש שעות מספיקות לקרדיומיוציטים לדבוק על פני השטח. אז transfection יכול להתבצע בשש שעות לאחר ציפוי. ריאגנט טרנספיקציה RNA IMAX שימש להשתלת קרדיומיוציטים עם siRNAs.התקשורת התרבותית מכילה 25 דם מיקרומולארי Staten בתוספת 10%FBS, אשר מצאנו מתאים יותר לבצע תרבות cardiomyocyte לטווח ארוך לגרום ניתוח התפשטות. לאחר ההמרה, ניתן להציג את הקרדיומיוציטים על ידי מיקרוסקופיה תוך שימוש באינקובטור מיקרו כדי להפוך את התאים להדמיית זמן לשגות. אלה תמונות בהירות של קרדיומיוציטים בצורת מוט מנוקד בהגדלה נמוכה וגבוהה.כאן, אתה יכול לראות יום אחר יום הדמיה, אשר מציג שינויים מורפולוגיה קרדיומיוציט עכבר למבוגרים. אנו מאשרים כי cardiomyocytes הם בריאים והתכווצות בנקודות זמן מוקדמות, כמו גם לאחר דידול D ותרבות לטווח ארוך. הנה דוגמה של כתם immunofluorescent Ki67 המדגים התפשטות המושרה של קרדיומיוציטים מבוגרים בתרבות לאחר siRNAs, transfection.כפי שניתן לראות מן התוצאות באמצעות טכניקה זו, אפשר להשיג קרדיומיוציטים מבוגרים בריאים מן העכבר עכבר וחולדה ותרבות אותם למחקר ארוך. לסיכום, לאחר שליטה בטכניקה זו תאפשר לנו ללמוד קרדיומיוציטים הרבה מעבר לפרוטוקולי הכת הנוכחיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...